外源基因在原核细胞中的表达系统
外源基因在原核细胞中表达是基因工程操作中最初取得成功的途径。
1 原核生物基因表达的特点
同所有的生命过程一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程:即 DNA转录成mRNA和 mRNA翻译成蛋白质。与真核细胞相比，原核细胞的表达有以下特点:
①原核生物只有一种RNA 聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有 RNA的合成。
②原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结
合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分:操纵基因(operator)、启动子
(promotor)及其他有调控功能的部位。
③由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。原核生物染色体 DNA
是裸露的环形 DNA，转录成 mRNA
后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。在翻译过程中，mRNA可与一定数目的核糖体结合形成多核糖体(Polyribosome)。两个核糖体之间有一定长度的间隔，为裸露的
mRNA。每个核糖体可独立完成一条肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条 mRNA 链上合成多条肽链，大大提高了翻译效率。
在双链 DNA 分子中，只有一条链转录成 mRNA，这条链称为有意义链(sense
strand)，该基因的另一条链则称反意义链(antisense strand)。在含有许多基因的 DNA
双链中，每个基因的有意义链并不是在同一条 DNA 链上。也就是说，一条链上既具有某些基因的有意义链，也含有另外一些基因的反意义链。由于 mRNA
聚合酶是沿着 DNA 链的 3’→5’方向移动，DNA 链与合成的 RNA链有反平行关系，所以 mRNA 链的合成方向是 5’→3’，mRNA
上的信息的阅读是从多核苷酸链 5'末端向 3’末端进行。从转录和翻译的方向也可看出，在原核生物细胞内当
mRNA的合成还没有完成时，蛋白质或多肤的翻译就己经开始了。
④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成 mRNA 前体后，其中内含子部分不能被切除。
⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA 合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3'末端碱基互补的序列，即 SD 序列，而真核基因则缺乏此序列。
从上述特点可以看到，欲将外源基因在真核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和 SD
序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：⑴通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；⑵外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用
cDNA 或全化学合成基因，而不能用基因组 DNA(genomic DNA)；⑶必须利用原核细胞的强启动子和
SD序列等调控元件控制外源基因的表达；⑷外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading
frame)；⑸利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害。
2 原核生物作为受体细胞具备的特点
外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中
有效表达，产生目的基因产物(目的蛋白)。由此可知，外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。
目前应用最广泛的是原核生物基因表达系统，如大肠杆菌表达系统、芽胞杆菌表达系统等。原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：
①原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
②基因组结构简单，便于基因操作和分析。
③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。
④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。
⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。
⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。
近年来，真核生物基因表达系统发展很快，真核生物如酵母菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等也被广泛用作基因表达系统的受体细胞，并构建了一系列相应的表达载体。要使外源基因在细胞中高效表达，构建的表达载体必须具备基因表达的基本条件，这些条件包括外源基因在细胞中的拷贝数、基因转录的水平、mRNA
翻译的速率等。大肠杆菌是一种革兰氏阴性细胞，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短，目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，它是目前为止应用最广泛的基因。
3 在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略
大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，高效表达外源基因必须考虑以下基本原则：
①优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA
翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD
序列中6～8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG
之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。
②提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的
频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。如编码 Pro 的密码子包括
CCG、CCC、CCU 和CCA
等，而其中的表达系统。第一个密码子在大肠杆菌的基因中都高频地出现，而另外三个密码子出现的频率很低。同义密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA
的丰度呈正相关，稀有密码子的 tRNA在细胞内的丰度很低。在
mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的
tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。
③提高外源基因 mRNA 的稳定性。大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。对于 mRNA
来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解，二是改变外源基因 mRNA
的结构，使之不易被降解。
④提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达
产物的诱导下，
蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子。
⑤优化发酵过程。由于细菌在 100L 以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下
200mL
摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。生物学方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH
值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。
