细胞爬片的制作方法
【爬片的准备】
1. 爬片：
24*24盖玻片，刚好用于6孔板。也可用更大的盖玻片，放在大的培养皿中爬片。
2. 盖玻片泡酸过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三
蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不
好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒、烤干。
3．盖玻片浸泡75%乙醇10分钟消毒，然后酒精灯上烤干，直接放入培养皿，开始种细胞。重点是玻片是干净的、无菌的。
4.盖玻片在液体中经常有贴壁吸附力，用一般镊子很难一次性夹起，将注射器针头针尖
向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以。
【细胞爬片】
1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使
玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
4. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。注意细胞不能太密，否则容易掉片。
【细胞爬片的固定】
1. 细胞爬片取出后，PBS洗2遍。但比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的
细胞在洗的过程中有可能会脱落。
2.常用的固定液
1.） 冷丙酮，可用于一般的免疫组化染色。将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
2. ）多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
3.） 95％乙醇，可用于免疫组化。
优点：穿透性强、抗原性保存较好。
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度室温固定
15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
4. ）甲醛(福尔马林)应用最广
优点：形态结构保存好，且穿透性强，
缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格
结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存。
【细胞爬片的组化染色】
1. PBS清洗标本 3次各2 min。
2. 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育 1次20min。（此步骤用于胞浆、胞核抗原）
3. PBS清洗标本3次各 2 min。
4. 3%H2O2孵育 15 min。
5. 余下步骤同石蜡切片组化染色。
