《科学》:CRISPR/Cas9首次在大型动物体内实现大规模基因编辑
今天，来自美国德克萨斯大学的Eric N. Olson团队在《科学》杂志上发表重要研究成果[1]，他们在全世界范围内首次实现在大型动物身上直接成功完成CRISPR基因编辑，部分器官高达92%的恢复程度让研究人员感到惊讶，连CRISPR技术的大牛Jennifer Doudna也表示“自己难以控制自己的兴奋”。
Eric N. Olson教授
这个成果向人们展示，CRISPR拥有在大型动物体内直接编辑大量体细胞基因组的能力，为诸多疾病的治疗铺平了道路。毕竟，我们无法退回到受精卵时改变自己的基因。
为什么我们说用CRISPR直接编辑大型动物意义非凡？
因为以往的研究多是在体外对细胞进行编辑，再送回体内。不过这种方法目前还主要用于少数血液疾病，对于拥有近40万亿细胞的人类，很多器官和组织的疾病就无法用这种方法治疗了，比如肌肉或内脏等等。
也有在小鼠中直接注射CRISPR进行体细胞编辑的试验，但人体比小鼠大了几百倍，需要高几个数量级的CRISPR载体，可能要面临更多的脱靶，更低的编辑效率，以及更强的免疫排斥等等问题。小鼠离复杂的人体还差得太远，这时大型动物试验的意义就凸显了。
Olson团队这次就是要解决这个问题的。他们选择的大型动物是人类的好朋友狗狗，治疗的疾病是杜氏肌营养不良症。这种遗传病在狗身表现了很多人类的病理和临床特征，这也是选择狗作为研究对象的原因之一。
杜氏肌营养不良症并不算罕见，全世界有超过30万患者。这种病是一种X染色体隐性遗传病，所以主要发生在男孩身上。它会使患者全身性肌肉萎缩（注意是全身哦，心肝肺等部位的肌肉都包括在内），很小时便失去行走能力，后来甚至连呼吸的力量都会退化，通常在20-30岁时就会死于呼吸衰竭。
杜氏肌营养不良症发病的原因是dystrophin基因发生了突变，这个基因编码的支架蛋白主要负责支撑肌肉结构。突变使这个支架蛋白失去功能，造成患者全身肌肉退化，包括骨骼肌和心肌等。
杜氏肌营养不良症患者
这个基因结构非常复杂，包括79个外显子。这些外显子正常情况下，在翻译后成蛋白后会有序地排列，就像一个乐高积木。但他们的第45-50个外显子容易发生突变，然后就使积木变得奇形怪状。科学家仔细研究发现，第45-50外显子捣乱，反而会使相邻的第51个外显子受影响，让它看起来像是外来者，阻碍整个积木的搭建[5]。
有意思的是，当科学家把这个51号拿掉之后，这个积木就能摆好了，功能也恢复正常。所以目前治疗这个病的方法就是，让基因转录时跳过这个51号，把它从积木中拿出去。但这个疗法只能让患者的这个蛋白到正常人0.22%-0.32%的水平，少得可怜。
既然是基因上出了问题，何不在基因上直接解决呢？身为上帝手术刀的Crispr战士觉得自己可以大展拳脚了，身怀绝技正愁没处施展抱负。
这次被选中的正是患有杜氏肌营养不良症的四只的可怜小狗，他们年仅1个月。而载着CRISPR/Cas9去细胞内进行基因编辑作业的正是腺病毒载体。这次作业的主要任务是在51号外显子处进行编辑，使其在转录时被跳过去。
腺病毒载体是在基因治疗领域奋战的老兵，在上一个基因治疗时代便一直战斗在最前线，虽然屡屡折戟，但壮心不已。这次与Crispr相遇，可谓绝配。
全身的肌肉细胞不可计数，首次出征，不可贸然全面进攻，况且敌人隐藏在我方境内，若打草惊蛇，可能会伤及无辜。于是科学家决定先试探敌人虚实，重点进攻一处。
科学家们首先选取了两只患病的小狗，将带有CRISPR/Cas9的腺病毒注射进小狗的一处骨骼肌中。6周后，取注射过腺病毒的肌肉组织进行检测。对肌肉组织的进行检测发现，正常功能的Dstrophin蛋白表达量达到了正常小狗肌肉组织的60%，而未注射得病小狗的只有2%，非常明显的恢复！而之前研究表明，恢复到15%就会有很明显的治疗效果[7] 。
正常小狗与患病小狗肌肉注射Crispr 前后组织蛋白水平
对肌肉进行检测发现，肌肉的萎缩症状明显减轻，其他病症也显著缓解。同时，检查免疫标志也显示，治疗没有明显的免疫排斥反应，证明治疗是有效且安全的。
正常小狗与患病小狗注射Crispr 前后肌肉组织形态变化
初战成功！
试探性进攻，战果不小，接下来就是全面进攻了！
科学家们的最终目的是修正全身的肌肉组织，所以必须要扩大战场，那么通过静脉注射将CRISPR/Cas9载体运送到全身各处才是正途。同时，为了避免伤害到其他细胞的基因组，让Crispr/Cas9系统只在肌肉中发挥作用，表达系统是用肌肉特异型启动子驱动的。
他们根据小狗的体重调整了腺病毒的剂量，将腺病毒注射进另外两只患病小狗的血液中。注射8周后，取小狗身体各处的肌肉组织进行检测。蛋白含量分析显示，目的蛋白在小狗的胫骨前肌、肱三头肌、肱二头肌、膈肌、心脏和舌肌的水平分别达到野生型的70%、25%、64%、58%、92%和5%。全身各处肌肉都有不停程度的恢复，尤其是心肌中，几乎完全恢复！
正常小狗与患病小狗肌肉静脉注射Crispr 前后组织蛋白水平
对小狗的肝肾功能以及造血功能进行检测，发现各项指标都正常，治疗并不会对小狗造成其他伤害。研究者们也对CRISPR/Cas9可能的脱靶效应进行了检测，与对照相比，并没有发现脱靶存在。
本次对小狗的治疗没有造成不可控的安全性问题，CRISPR/Cas9系统首次在大型动物体内的实验成功了。
当然，这次实验样本数量较少，只有四只，且对CRISPR/Cas9脱靶效应的检测只进行到6-8周，安全性问题还需要更多更大的实验进行验证。文章并没有提及小狗生理状态的恢复，比如肌肉力量等等，也还需要进一步的探索。
此外，由于是对体细胞进行的编辑，也就是说新产生的细胞可能还是有缺陷的，疾病还是不能根治，不过与之前的疗法相比，显示了巨大的提升潜力。当然，腺病毒本身的价格还是挺贵的，对于很多人来说难以承担。
本文作者也表示，现在还不急于进行人体试验，还需要继续检验它的安全性和持久性。
但是，本次研究的意义已不须我们多说，仅治疗8周就对全身的肌肉细胞产生了如此大的改善，且效率之高，令本研究的参与者都感到惊讶。
我相信CRISPR临床治疗的时代不远了。
