本 方 案 用 单 核 细 胞 增 生性 利 斯特 氏 菌 株 感 染 小鼠材 料单核细胞增生性利斯特氏菌（单 元 6. 6 和单 元 7. 7) 无菌的脑、心 脏 浸 剂（B H I ) 肉 汤 培 养 基（Difco) PBS 小 鼠 分光光度计 红外线灯 小鼠操控装置 I m l 吸管 27 G 针头 1.准备单核细胞增生性利斯特氏菌（如 10403s 菌株），用 无 菌 B H I 肉汤培养基 37°C 培养 ，也可用无菌的 B H I 肉 汤 琼 脂 平 板（单 元 7.1)，或 胰 蛋 白 胨 磷 酸 盐 肉 汤（单元 6. 6 ) 进行培养。 2 . 测 定 600m n (A 600 ) 的吸光率检测早期对数生长期的细菌生长，用 P B S 把浓度调整到 10 OOO 个细胞/ml。 由于单核细胞增生性利斯特氏菌的生长速率和吸光率的差别，在感染小鼠之前最好进行标准化的处理。用肉汤 37°C 培养单核细胞增生性利斯特氏菌，每 隔 I h 测定A 600处的吸光度，持续测定 6〜8 h 。在每个时间点，培养物用 P B S 稀释，接种在无菌肉汤琼脂平板上培养 24 h ，用平板上的细菌克隆数来验证相关的焱_数值。 43251、10403s 细胞株在 A 600刚处每 0. 1 代表了大约 2 X I O 8 个细胞/m l 细菌。 3 . 红外线灯照射小鼠 5〜lOmin，把小鼠放进一操控装置，用 I m l 注射器和 27 G 针头经小 鼠 尾 静 脉（附 录 2E ) 接 种 0.2m l 稀释的利斯特氏菌液（2000 细菌）。把小鼠放置于 B L -2 实验室进行特异性的免疫反应实验（见 辅 助 方 案 1 ) 或者诱导细菌特异性 T细 胞 系（见辅助方案 2)。 利斯特氏菌感染小鼠 7〜8d 产生特异的丁细胞反应。如果免疫的小鼠是用来研究机体对利斯特氏菌的特异性免疫反应，要 在 感 染 3 周 、最 好 5 周进行实验，以排除非特异性的炎症反应的干扰。 辅 助 方 案 1 小鼠感染利斯特氏菌后的特异性和固有免疫反应评估附 加 材 料非 免 疫 小 鼠（可选） 0 •0 5 % (v/V ) TritonX-IOO 无菌的脑、心脏浸剂肉汤琼脂平板 无菌不锈钢滤网 50m m 无菌培养皿 12m m X 75m m 无菌聚苯乙婦管 无菌玻璃涂棒 1 . 准备单核细胞增生性利斯特氏菌（见基本方案步骤 1〜2)，调 整 浓 度 到 IO6个细胞/m l 。每一个实验组注射 3〜5 只小鼠，每只小鼠注射 0.2 ml (2X 105 个细菌，见基本方案步骤 3)。 这个剂量代表了约 l O X B A L B / c L D 5Q，因此只适合用于具有同样免疫力的小鼠。正 常（naive) 小鼠可用来检测用亚致死量的单核细胞增生性利斯特氏菌通过 i.V•感染小鼠后所产生的特异性免疫反应和固有免疫反应，可在感染小鼠 48〜72 h 检测固有免疫反应及在 7〜IOd 检测特异性的免疫反应。 2 . 把感染后的小鼠置于 B L -2 实 验 室 24〜48 h 。每天观察小鼠的得病状态（毛色、精神状态），处死即将死亡的小鼠。 3.把不镑钢滤网分别放到两个各加有 5m l 含 0 •0 5 % Triton X -IOO 的 50m m 无菌培养皿中。感染小鼠 24〜48 h 后 ，脱 颈 处 死 小 鼠（附 录 2 G ) ，取脾脏和肝脏各自放于滤网上 。用 5m l 注射器的橡胶棒挤压脾脏和肝脏，通 过 滤 网 ，使 Triton X -100 和组织
混匀。 4 . 准 备 3 个无菌的 12m m X 75m m 无菌聚苯乙烯管，各 加 入 0.9m l 的 0.05% Triton X -100。第一个管中加入 0.1m l 的组织勻浆液，混匀，再从第一个管中取 0.1m l 混匀液加入第二个管中，混勻。第三个管子添加第二个管子里的 0.1m l 混匀液。 5 . 从每一个稀释的管中取出 IOiUl 放于新鲜 B H I 琼脂平板的中央，用无菌玻璃涂棒涂匀接种。平板置于 37°C 温箱中孵育 2 4 h 。 6 . 统计每一个平板的克隆数，根据所涂布液体的体积和稀释度，计算出每个器官里所含有的细菌总数。 辅 助 方 案 2 利斯特氏菌特异性 T 细胞的制备附 加 材 料J7 7 4 巨噬细胞样细胞（A T C C # T I B 67) 无抗生素的完全培养基 10 含 5/xg/m l 庆大霉素的完全培养基 10 (其他的抗生素代替） 单核细胞增生性利斯特氏菌感染的小鼠（见基本方案） 填充用的脾细胞 大鼠刀豆凝聚素 A (C o n A ) 活 化 上 清（单 元 2. 12)
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