染 性 疾 病 动 物 模 型——弓 形 虫 感 染 动 物 模 型
| 实验步骤 |
基本方案 1 诱导小鼠急性弓形虫 T. gondii感染材 料T. gondii弓形虫 M E 4 9 株 慢 性 感 染（1 个月以上）的 雌 性 小 鼠（C 57B L /6、 C B A /Ca 或 Swiss-Webster) (见辅助方案 2)。 7 0 % (v/V ) 乙醇 P B S , p H 2 无菌原体小鼠，雌 性（6〜8 周龄，见 表 11. 2 . 1 中易感品系） 剪刀 小钳状骨针 研钵和研棒 带 22 G 针 头 的 I m l 或 3m l 注射器 载玻片和 22m m X 22m m 的盖玻片 18 G 、 I.5in (3. 8c m ) 强饲针 1.C O 2 吸 入 法（附 录 2 G ) 处 死 感 染 的 小 鼠 ，并 用 7 0 % 乙醇清洗头部。切开皮肤暴露颅骨，用小弯剪刀打开颅骨，暴露大脑，取出大脑组织置于研钵中。 2 . 脑组织研磨后加入 Iml P B S ，用 带 有 22 G 针 头 的 I m l 或 3m l 注射器反复的吸、吹悬液进行勻浆。 3 . 取 20ul 样品滴于载玻片上，制三份片子，盖 上 22m m X 22m m 的盖玻片， 100 倍显微镜下观察，并计数整个片子中的包囊数。计算三个片子的平均包囊数，换算出每毫升脑悬液中的包囊数。用 P B S 把脑匀浆液中的包囊稀释至所要求的浓度（50〜500/ml) 4a. 腹腔内感染：用 带 有 22 G 针头的注射器给清洁级雌性小鼠腹腔注射 0.2m l 的脑组织勻 浆 液（通 常 含 10〜2 0 个组织包囊）（附 录 2E )。 所用的包嚢数越多， B A L B /c 与 C B A /C a 小鼠之间的易感性的差异就越明显。膜内感染 20、 4 0 或 8 0 个包嚢后，分 别 有 1 2 % 、 5 0 % 、 7 5 % 的 B A L B /c 小鼠感染 3周内死亡，而在相应时间内没有观察到有感染的 C B A /C a 小 鼠 死 亡（Suzuki 衫 ci/.， 4b. 口腔感染：用 18 G 、 1.5in 强 饲 针 将 0.2m l 包囊悬液注射给清洁级雌性小鼠（一般10〜100 个包囊）。 5 . 评 估 感 染 进 展 和（或）机 体 免 疫 应 答（见辅助方案 1)。 基本方案 2 小鼠慢性弓形虫脑炎模型材 料无 病 原 体 易 感 品 系 小 鼠（雌 性 6〜8 周 ；易 感 品 系 小 鼠 见 表 19. 3 . 1 ; 饲养见单元1. 2) P B S , p H 7. 2 带 有 22 G 针 头 的 30m l 注射器 1 . 用 10〜2 0 个 包 囊 的 M E 4 9 经 口 腔 或 腹 膜 感 染 易 感 品 系 小 鼠（见 基 本 方 案 1 ，步骤4)。 2 . 在感染后 4 周 和 8〜1 0 周（见 辅 助 方 案 1 的临床评估）用 甲 氧 氟 烷 麻 醉 小 鼠（附录2 D ) 。 打开胸腔，用 带 2 2 G 针头注射器经左心室灌注 20 ml P B S 入循环系统，去除大脑血液。 3 . 如基本方案 1 中所述取出大脑，然后评估弓形虫脑炎进展情况（见 辅 助 方 案 1)。评估一个以上的参数，矢状分离大脑半球。 基本方案 3 感染 r.gowdf/ 的重症联合免疫缺陷小鼠重症联合免疫缺陷小鼠（SCID) 缺 少 T 细 胞 和 B 细胞。当 用 M E 4 9 感染小鼠时，感 染 后 2〜3 周死亡。为制作慢性感染，可给予磺胺嘧啶，而当磺胺嘧啶停药后可造成感染的重新加重并死亡。此模型模仿弓形体脑炎在免疫宽容个体的发病机制。本实验可通过 回 输 T 细胞或其他细胞给 S C I D 鼠来研究这些细胞对 T . f 的免疫应答。 材料无病原体感染的 C B-17S S C I D 小 鼠（雌 性 6〜8 周龄，Jackson 实验室供给） 磺 胺 嘧 啶（Sigma) Naive 小鼠淋巴细胞悬液（单 元 2.1) ， 免 疫 动 物（即 ts-4 株感染的小鼠；见基本方案 4)，或 M E 4 9 慢 性 感 染（1 个月以上）的 B A L B /c 小鼠 1 . 雌 性 6〜8 周 龄 C .B-17S S C I D 小鼠饲养于顶盖过滤型饲养笼内，置于层流柜，自动喂饮高压灭菌的食物和水。 2 . 经口腔或腹腔给予 10〜2 0 个 T .gondii M E 4 9 包 囊 以 感 染 小 鼠（层流柜内操作，见基本方 案 1)。 3 . 慢性感染模型：感 染 后 3〜IOd 开始用磺胺嘧啶处理动物（200m g /L 饮用水），持 续 3周 。 停 止 应 用 續 胺 嗔 咬 后 ，死 亡 率 取 决 于 感 染 后 起 始 给 药 的 时 间 ，给 药 越 早 存 活 时间 越 长（如 感 染 后 3d 给 药 ，可 存 活 3 周）。 4 . 细胞）过继试验：停 止 给 磺 胺 嘧 啶（再活化慢性感染模型）( I d 前 ，静脉或腹腔给予 IX IO7〜5 X I O 7 的 naive 小 鼠 或 T. gondz’f 免 疫 小鼠的淋巴细胞悬液（附 录 2 E 感染技术）。 5 . 评估 感 染 进 展 和（或）机 体 免 疫 应 答（见辅助方案 1)。 基本方案 4 温度敏感的 TS-4 T. 菌株的感染模型材 料ts-4 菌 株 速 殖 子（见辅助方案 3) 无病原体雌性小鼠（6〜8 周龄） H B S S P B S 带 有 26 G 针 头 的 I m l 注射器 1 . 如辅助方案 3 中描述的，冷 冻 保 存 在 人 类（阴茎）包皮成纤维细胞中 ts-4 菌株速殖子 ，复苏时将水浴温度调至 33°C 。按照辅助方案 3 的方法破碎细胞收集速殖子，并通过离心去除速殖子悬液中的人成纤维细胞。 2 . 小鼠经腹腔注射含 IXlO4 速殖子的 PBS (附 录 2E )， 4〜8 周 后 ，腹腔加强注射 2XIO5 速殖子。再 经 过 2〜4 周 ，重复加强一次。 3 . 最 后 一 次 加 强 注 射（附 录 2 H ) 1 周 后 ，无 菌 收 集 脾 脏 ，制 备 脾 脏 细 胞 悬 液 ，用H B S S 配 成 IXlO8〜2X108个细胞/m l 的 悬 液（单 元 2.1)。 4 . 用 带 有 26 G 针 头 的 I m l 注射器，将 0.2m l 细 胞 悬 液（2 X 107〜4 X 107 个）经尾脉注射 入 naive 小 鼠 中（附 录 2E )。 辅 助 方 案 1 对 T.gondii 感染进展和免疫应答的评估材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)T .gonii 感 染 的 小 鼠（见基本方案 1、 2 或 3) 固定剂 抗 多 克 隆 抗 体（BioGenex Laboratories) la. T .gonii 急性感染模型：感染后第一周的不同时间， CO2 吸 入 法 处 死 小 鼠（附录2 G ) ，取出肝脏、肺脏、心脏、大肠、小 肠 和 肠 系 膜 淋 巴 结（口腔感染情况下）做组织病理学检查。 lb. 弓形虫脑炎模型：采用 0 〇 2 吸入法处死小鼠。（对免疫潜能健全动物）感 染 4〜10周后取大脑，而 对 S C I D 小鼠制备的慢性感染模型，在磺胺嘧啶停药后要每周进行上 述 操 作（见基本方案 3)。 2 . 所取部分器官在固定液中室温固定过夜。 3 . 每种器官制备 2〜4 份 5/xm 厚 度 的 组 织 切 片（间 隔 50〜IOOiLtm )。 4 . 苏木精/伊红染色标本，观察炎性改变，并 用 抗 T.gondii 多 克 隆 抗 体 对T.gondii 病 |
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