Western Blot (免疫印记法)常识问答
1. 什么是western blot?
答：WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。
2. western blot 有什么优点？
答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。
3. western blot 的具体步骤是什么？
答：一. 制样（以提动物组织总蛋白为例），
1） 组织洗涤后加入3 倍体积PBS，0℃研磨。
2） 加入5×STOP buffer
3） 180W, 6mins，0℃超声波破碎
4） 5000rpm，5mins 离心，取上清。
5） 加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）
6） 煮沸，10min
7） 分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
二． 电泳（SDS-PAGE）
建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5
％胶。
1）配胶（one piece）A.分离胶。单位：ml。Total: 8ml
7.5％ 10％ 15%
2×Sep. buffer 4 4 4
30％ Gel.sol 2.0 2.7 4
ddH2O 1.9 1.2 0
TEMED 8ul 8ul 8ul
10%APS 80ul 80ul 80ul
B. 浓缩胶。单位：ml。Total: 3.5ml
3％
2×Stacking. buffer 1.7
30％ Gel.sol 0.35
ddH2O 1.4
TEMED 5ul
10%APS 50ul
2)点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则
载荷面为：1mm×5mm=5mm2)
3）电泳。开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。
4）转移（一块胶）。
A.半干法。
a. 取六张滤纸（Bio-Rad，1mm），三张做上层滤纸，三张做下层。其中，
上层滤纸一定要比较干净，无污染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少
五分钟。
b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后，再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。阳极上铺三张下层滤纸，再浸泡过的膜，再铺胶，然后铺三
实验方法互助区——蛋白区
张上层滤纸，最后铺上三张上层滤纸，盖上阴极。注意每层之间不能有
气泡。膜上用铅笔画出胶的边缘。标上下。
d. 转移，0.8mA/cm2-3mA/cm2. 经验是：100kd-200kd，用2mA/cm2，2hrs；
30-100kd用1.0-2.0mA/cm2，40mins-1.5h；10kd-30kd％用0.5-0.8mA/cm2，
15mins-40mins.
B.湿法。
a. 取四张滤纸，两张做上层滤纸，两张做下层。其中，上层滤纸一定要比较
干净，无污染。
b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。
e. 转移。抗原≥100kd, 先28V转移1h, 然后84V转移14-16h, ≤100kd， 则
63V转移4-16h.
三 封闭：5％牛奶4℃封闭过夜，或RT 1hr.
四 第一步反应：5％牛奶或2％BSA稀释抗体（称一抗），稀释比例按抗体说明,室温
孵育1hr，
五 洗涤：TBST 洗5 mins 3-5 次。
六 第二步反应：将膜跟5％牛奶或2％BSA稀释的2 抗一起孵育，室温1hr。
七 洗涤：TBST 洗5 mins 3-5 次。
八 显色：
4. western blot 所需buffer 的配方是什么？
答：主要的buffer有：
1） 2×Separation buffer (PH: 8.8)
0.75M TRIS.HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS
Total: 1000ml
2) 30% gel Solution
0.8% kis-aciylamide 0.8g
29.2% aciylamide 29.2g
Total: 100ml
3）10％ APS: 0.1g 溶于1.0ml ddH2O.
4) 2×Stacking buffer(PH: 6.8)
0.2M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS
Total: 500ml
5) 10×Running buffer(PH: 8.3)
250mM Tris 60.55g
1.9M Glycine 285.27g
1% SDS 20g or 100ml 20% SDS
Total: 2 liters
6) Semi-dry transfer buffer(PH:8.3):
48mM Tris 5.8g
39mM Glycine 2.9g
0.037% SDS 0.37g
实验方法互助区——蛋白区
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
7) Wet transfer buffer 1(PH: 8.3): （20－400kd）
50mM Tris 5.8g
380mM Glycine 29g
0.1% SDS 1.0g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
8) Wet transfer buffer 2(PH: 8.3) ＜80kd
25mM Tris 5.8g
190mM Glycine 29g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
9) blocking buffer:
5% milk 5g
TBST 100ml
※：奶粉为脱脂奶粉。
10) 10×TBS (PH: 7.6)
NaCl 80g
Tris 30g
Total: 1000ml
11) TBST (PH: 7.4)
NaCl 25mM
Tris 100Mm
Tween-20 0.2%
Total: 1000ml
12) 5×STOP buffer (PH: 6.7)
20% Glycerol 100ml
10% SDS 50g
250mM Tris 15.14g
用时取9.0ml，加入0.5ml β-ME和0.5ml 溴酚蓝，可制成sample buffer。
5. western blot 常见问题有那些？
1) 为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
答：原因有很多，1 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMST，抑制蛋白酶活性；3 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
2）我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
答：1 有沉淀可能是因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，2 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量sample buffer即可。
3）我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？
答：可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其
他按步骤即可。
4）我的目的带很弱，怎么加强？
答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。
实验方法互助区——蛋白区
5）胶片背景很脏，有什么解决方法？
答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，牛奶浓度提高。
6）目标带是空白，周围有背景，是为什么？
答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
7）我的胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；2 ECL底物中H2O2，不稳定，失活；3 ECL
底物没覆盖到相应位置；4 二抗失活。
8）问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：1可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.
胶片本来就被曝光了2显影时间过长.
9）DAB好还是ECL好？
答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。
10）抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事？
答：抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。在上层胶中加入尿素至8M也可以打开。
11）半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？
因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？
什么是短路？如何控制和发现短路呢？
答：一般参照膜>= 滤纸> 胶, 就行，
你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
12）电泳时Marker 按说明加5ul，但电泳中看不见，是失活了吗？
答：加入20ul即可。
13）蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么了？
答：可能是1样品浓度过低2转移时间不够，。
14) 我的一抗量较少，同时我也不知道一抗的最佳稀释比例是多少，怎么做呢？
答：确定实验过程无污染后，将含抗体的稀释液回收，保存于-70℃。最好第一次的浓度做高一点，这样，如果结果不好，可以尝试再稀释。
