Affymetrix Barley 基因芯片筛选发现小麦白粉病抗性基因Stpk-V
小麦是目前世界上种植最广泛的粮食作物，全球至少三分之一的人口以小麦为主食。而小麦白粉病（powdery mildew）严重影响小麦的产量，小麦白粉病是由白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tri1ci，Bgt）引起的世界性真菌病害，培养小麦白粉病抗性品种是控制白粉病的有效途径。
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室的陈佩度教授是小麦遗传育种的专家，他曾将簇毛麦（Haynaldia villosa）抗白粉病基因定位于6V染色体短臂，这一染色体区段后来被命名为Pm21。簇小麦-普通小麦易位系T6VS-6AL具有持久、广谱的白粉病抗性，这也从一个侧面证明了Pm21具有稳定的白粉病抗性功能。然而Pm21染色体区段上白粉病抗性基因的精细定位用传统的分子遗传方法却很难实现，因为簇毛麦的6VS染色体区段与普通小麦的6AS不配对。
在本研究中，陈佩度教授领导研究小组利用基因芯片等技术手段，克隆并鉴定出Pm21基因簇的关键成员——丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶基因（Serine/threonine kinase gene，Stpk-V），此基因赋予了小麦白粉病抗性。该研究成果发表在2011年的PNAS杂志上。相关的基因芯片技术服务由上海伯豪生物技术有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心（www.ebioservice.com）完成。
一、基因芯片筛选发现Pm21染色体区段处的白粉病抗性基因
研究小组首先利用基因芯片（Affymetrix Barley GeneChip）比较Bgt感染前后的簇毛麦表达谱，发现Bgt感染后，共有196个基因表达量增加了一倍，其中有131个基因具有明确的功能。在这131个基因中，研究人员发现了4个抗性相关基因（resistance gene analogues，RGAs），而其中只有一个基因位于簇毛麦的6VS区段，这个基因就是Stpk-V。随后研究人员用RT-PCR的方法对基因芯片的结果进行了验证，并用RACE的方法获得了Stpk-V基因的cDNA全长，并用可转化人工染色体（transforma Mon-competent arMficial chromosome，TAC）文库的方法获得了Stpk-V基因全长，Stpk-V基因共有6个外显子和5个内含子。研究小组又用FISH和GISH的方法对Stpk-V进行基因组定位，证实它确实位于6VS的FL 0.45-0.58染色体区段上，这一区段正是Pm21基因簇的位置。
二、Stpk-V的功能分析
吸器（haustorium）是真菌生长过程中获取营养物质的关键器官，吸器指数（haustorium index）也常被用来衡量真菌的生长状况。研究小组利用瞬时表达的方法对Stpk-V对Bgt感染小麦的吸器指数进行了研究。
如图所示。Yangmai158小麦是Bgt敏感型，易位系小麦T6VS-6AL则具有Bgt抗性。当Yangmai158瞬时表达对照基因GUS时，吸器指数高达54.8%；而Yangmai158瞬时表达GUS+Stpk-V时，吸器指数降低到13.6%。T6VS-6AL瞬时表达GUS，吸器指数为14.1%。这一结果表明，瞬时表达Stpk-V会抑制Bgt的生长。
Bgt感染T6VS-6AL和Yangmai158，随后用RT-PCR分析Stpk-V的表达情况，发现Bgt的感染能增加T6VS-6AL中Stpk-V的表达量，而Yangmai158中则检测不到Stpk-V的表达。用病毒诱导的基因沉默系统（virus-induced gene silencing system, VIGS）抑制簇毛麦和T6VS-6AL中的Stpk-V，会导致吸器指数的增加。
三、Bgt抗性的机制研究
在Bgt感染T6VS-6AL易位系小麦后，可以观察到明显的因超敏反应（HypersensiMve Response，HR）引起的细胞死亡。植物的超敏反应是植物应对病原菌侵袭的一种保护性措施，主要表现是受侵细胞及其邻近细胞的快速坏死，从而遏制病原菌的生长。研究人员推测Stpk-V对Bgt的抗性可能也是通过超敏反应实现的。
超敏反应最常见的信号分子是H2O2，于是研究人员开始研究三种小麦（Bgt敏感型Yangmai158，Bgt抗性型T6VS-6AL，转化型pAHC：Stpk-V）在Bgt感染后H2O2的积累情况，并与生存情况对比。结果显示，在Yangmai158中，H2O2仅在Bgt感染的初期大量富集，随后含量降低，也没有超敏反应的发生。而在T6VS-6AL和pAHC：Stpk-V中，H2O2始终存在，从而能引起超敏反应，遏制Bgt的进一步侵袭。
综上所述，研究小组利用表达谱芯片的方法比较Bgt感染前后的簇毛麦表达谱，筛选到了位于Pm21基因簇上发挥Bgt抗性功能的基因Stpk-V，随后利用吸器指数实验和瞬时表达实验证实Stpk-V确实能抑制Bgt的感染，最后通过比较三种不同基因型小麦在Bgt感染后H2O2的积累情况，发现Stpk-V对Bgt的抗性可能和植物的超敏反应有关。
原文出处：
Cao A, Xing L, Wang X, Yang X, Wang W, Sun Y, Qian C, Ni J, Chen Y, Liu D, Wang X, Chen P. From the Cover: Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108(19): 7727-7732.
来源：上海伯豪生物技术有限公司
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