基因的翻译表达-2
方法
1：重组载体构建同前面实验
2：诱导表达：提取带重组片断的质粒DNA转化BL21（DE3）受体菌37℃活化过夜，转入新鲜培养基摇菌至对数生长期（约2－3小时），加入IPTG至终浓度0.4mM，继续培养6小时
3：表达产物提取及鉴定见实验十九
二：融合表达
仪器：同上
材料及试剂：载体PinPointX(图17-2),菌株JM109，诱导剂IPTG及PinPoint纯化试剂盒所带试剂。
图17-2PinPointXa载体结构图
方法
1：重组载体构建同前面实验
2：诱导表达：提取带重组片断的质粒DNA转化JM109受体菌37℃活化过夜，转入新鲜培养基(含2mMbiotin)摇菌至对数生长期（约2－3小时），加入IPTG至终浓度0.1mM，继续培养4-5小时
3：表达产物提取及分析按图17-3进行.
其原理为Softlink树脂上结合有生物素亲和基团,该基团能与融合蛋白中来自于载体的前导肽亲和结合,因此利用亲和层析原理可特异性提取纯化融合蛋白.由于来自以载体的前导肽的C末端有专一性的Xa蛋白酶的作用位点,因此纯化后的融合蛋白用Xa蛋白酶切割,即可释放出外源基因蛋白
具体为
A:细胞裂解(冰浴操作)
a:离心沉淀细胞,沉淀悬浮于10倍体积(ml/g细胞沉淀)的细胞裂解液(50Mm Tris-HCl,pH7.5,50mMNaCl,5%甘油)
b:加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml,冰浴搅拌20min
c:加入DOC(脱氧胆酸钠盐)到终浓度0.1%,冰浴搅拌5min
d:加入200UDNase以降低黏度
e:10000g,15min离心取上清
B:上柱
a:装柱,用含5mM生物素的平衡液(50mMTris-HCl,pH8.0,含50-200mMNaCl,4Mmdtt,2Mmedta,10%甘油或0.1%TritonX-100)(2倍柱体积)浸泡柱材(Softlink树脂),取1ml装入专用层析管中
b:平衡柱,用8柱床体积的10%乙酸洗柱,再用8柱床体积的100mMpH7.0磷酸盐(磷酸钠)缓冲液洗柱(要求流出液pH达到6.8)
c: 用1体积平衡液平衡柱
d:将细胞裂解后的上清液浓缩后溶于平衡液中,上样
C:洗脱
a:洗柱,上样后用5柱床体积的平衡液洗柱,以洗脱未结合到柱上的杂蛋白
b:洗脱蛋白,用含5mM生物素的平衡液洗脱,直至蛋白峰出现。
