转染细胞的稳定筛选实验
| 实验方法原理 | 外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代。外源基因进入培养细胞一般要经过几天才能够整合入基因组DNA。 |
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| 实验材料 | 转染细胞 |
| 试剂、试剂盒 | 抗生素 培养基 胰酶 |
| 仪器、耗材 | 6孔板 24孔板 96孔板 CO2培养箱 滤纸片 培养瓶 |
| 实验步骤 |
1.确定抗生素作用的最佳浓度： 不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。 1） 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2 孵箱中37℃培养过夜。 2） 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000ug/ml）。 3） 培养10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准，一般为400-800ug/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半。 2.转染按前面的步骤进行。 3.转染72 小时后按1:10 的比例将转染细胞在6 孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6 孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。 1） 滤纸片法：用消毒的5x5mm 滤纸片浸过胰酶，将滤纸片贴在单细胞集落上10-15 秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24 孔板中继续加压培养。细胞在24 孔板中长满后转入25cm2 培养瓶中，长满后再转入75cm2 培养瓶中培养。 2） 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10 倍稀释（10-2-10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96 孔板中培养，7-10 天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。 4. ELISA 或Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
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| 注意事项 |
1. 如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2. 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。
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