拟南芥转基因植株PCs含量的测定
实验概要
本实验测定了转基因拟南芥总谷胱甘肽(GSH)含量、非蛋白巯基(NPT)含量。
主要试剂
200 uM CdSO4，5% sulfosalicylic acid(含6. 3 mM diethylenetriaminepentaacetic acid <DTPA>)，Co-enzyme working solution，Substrate working solution (DTNB)，K2HP04，DTNB (10 mM)
主要设备
研钵，匀浆器，高速离心机，紫外分光光度计
实验材料
转基因拟南芥幼苗
实验步骤
用200 uM CdSO4处理盆栽25 days的转基因拟南芥幼苗(土壤中Cd的终浓度为12.2 mg/kg soil)，3 days后，分别称取拟南芥叶片0. 5 g，液氮研磨称粉末状，加入lml 5% sulfosalicylic acid(含6. 3 mM diethylenetriaminepentaacetic acid <DTPA>)。将匀浆4℃离心10 min X 12,000 g，收集上清分别用来检测总谷胱甘肽(GSH)含量和非蛋白巯基(NPT)含量。
总谷胱甘肽(GSH)含量的测定(按“Total Glutathione Quantification Kit"<DoJinDo Molecular Technologies，Inc.>)说明书进行：
1. 顺序加140 ul Co-enzyme working solution和20 ul enzyme working solution；
2. 30℃温育5 min；
3. 加20 ul样品液；
4. 30℃温育10 min；
5. 加20 ul Substrate working solution (DTNB)，室温静置10 min；
6. 于412 nm处测定吸光值，根据标准曲线确定GSH的含量。
NPT含量的测定：
1. 取样品液300 ul与630 ul K2HP04和25 ul DTNB (10 mM)(DTNB=Ellman's reagent=5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸))
2. 混合，室温静置2 min后；
3. 于412 nm处测定吸光值；
4. 根据以下公式计算NPT的含量：
Abs(sample)=(Tot. Vol./sample vol.) x (Abs412)
Sample Calculation：Ave. = Abs(sample)/13600=3.7 mM thiol
其中：Tot. Vo1=955 ul，sample vol=300 ul
PCs含量的计算：
PCs含量即NPT含量与GSH含量之间的差值。
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