HLA基因分型方法:PCR-SSO(ASO)探针法
PCR-SSO(ASO)探针法
1)常规提取DNA
参见RFLP法
2)PCR扩增
参见PCR-RFLP法
3)斑点杂交
1.将5~20μl扩增产物,加变性液100~200μl室温处理5~15min。
2.在尼龙滤膜(预先用2×SSC浸湿2min)上真空点样,每孔以10×SSPE 200μl冲洗,抽干,80℃干燥2h。
3.标记探针,取标记缓冲液2.5μl,寡核苷酸片段(dCTP, dGTP, dTTP)50~100ng,[γ-32P]ATP 2.5μl,T4多核苷酸酶10U,双蒸水加至25μl,混匀,37℃保温45min,用0.5mol/L EDTA 1μl终止反应,标记的探针可直接使用或采用柱层析分离标记好的探针。
4.点样膜于杂交前漂洗,放入杂交袋中,加入适量预杂交液2ml/250px2在杂交温度下预杂交10~60min,将适量标记探针加入预杂交液中,杂交1h~过夜。
5.洗膜,2×SSPE和0.1%SDS于杂交温度洗2次,最后根据探针的Tm值调整洗膜2次。
6.-70℃放射自显影,用保鲜膜包好杂交膜,放入暗盒,加增感屏,再放置X线片,置低温冰箱,感光时间须摸索。
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