用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项2
BRET融合结构的生产
构成编码BRET融合蛋白包括以下内容：
1. 表达Rluc-EYFP融合蛋白的BRET融合结构的阳性对照（见注2）。
2. BRET结构的阴性对照：如：单独表达Rluc和EYFP的pRluc, pEYFP，GPCRs对照（非感兴趣的GPCR）和其他融合了Rluc或者EYFP的蛋白，（见注3）。在我们的研究中，我们利用促性腺激素释放激素（GnRH）促甲状腺激素释放激素（TRH）和β2肾上腺素受体，他们都是C末端和Rluc和EYFP结合（见注3）。
3. 首个感兴趣的蛋白的BRET供体结构，（C末端（GPCR/Rluc）或者N末端（Rluc/GPCR）标记为Rluc的GPCR的表达）（见注4-6）。
4. 第二个感兴趣的蛋白的BRET受体结构（C末端（GPCR/EYFP）或者N末端（EYFP/GPCR）标记为EYFP的GPCR的表达）（见注4-6）。
BRET融合结构的转染和共表达
1. 根据操作说明使用转染试剂来转染哺乳动物细胞（如：COS-1细胞，在转染以前，放置一天使6孔板的每个孔的密度达到2*105个细胞）（见注7）。
2. 单独转染带有GPCR/Rluc融合cDNA细胞或者共转染带有GPCR/Rluc和GPCR/EYFP融合的cDNA（见注8）。Rluc 和 Rluc-EYFP BRET对照 cDNA也一同被转染，作为实验的阳性对照。阴性对照转染也同时进行，包括：其他GPCRs融合到EYFP或者Rluc上显示非特异性的BRET信号。（见注3 & 8）。
BRET实验
1. 转然后48小时，使用磷酸盐缓冲液（PBS）/0.05%胰蛋白酶分离细胞。用PBS洗涤两次，悬浮在500µl的PBS。使用EYFP表达的流式细胞仪或者LB940多功能酶标仪的荧光模块分析每次转染的大约100000个细胞。（见注6）..对于BRET，96孔板的每个孔中添加40µl细胞悬浮液（大约20000个细胞）
2. 注入10ul腔肠素（新稀释到25µM）到每个孔中，获得最终浓度为5uM,并立即使用带有预设为所需温度（37度）加热模块LB940进行读数（见注9，10）。
3. 测试在相互作用中的激动剂和拮抗剂（或者其他试剂，化学/处理）的影响，增强BRET信号，试剂可以在添加腔肠素前预孵育。或者添加腔肠素，控制“未处理”读数数据，最后通过注射器添加最多三个试剂，随着时间的推移评估BRET比率的影响。
4. 采用综合读数10秒，收集通过两个不同波长范围的的滤光片的光。
图1：测量BRET信号的读数选项。第一个标记的发光为Rluc滤光片选项，第二个标记的发光为EYFP选项。
用两次测量的结果根据下面的公式计算BRET比率。
BRET比率=530nm发射光/480nm发射光
5. 然后，数据作为一个标准化的BRET比率。定义为，在同一个实验中，Rluc和EYFP结构共表达的BRET比率比上Rluc结构单独表达的BRET比率。
说明：
1. 在BRET实验中使用的腔肠素的形式是非常重要的。几种不同形式的腔肠素的存在，每种可以导致稍微不同波长光的峰值发射光。为了能够发生能量转移，供体（Rluc）的发射光谱需要和能量受体（EYFP）的激发/吸收光谱显著重叠。另外，供体和受体的发射光谱必须能够足够的区分，以允许有最小重叠分子的发射光能够分开测量。考虑到这些因素，使用Rluc和EYFP分别作为供体和受体分子，腔肠素的H形式被使用在BRET实验中。腔肠素溶解在甲醇中作为储藏液（500µM）在–20oC下避光保存。仅仅在使用前，腔肠素被BRET试验缓冲液稀释到最终浓度为2µM, 用铝箔包装，以避光。
2. 为了确认BRET信号可以在实验条件下获得，应该使用BRET阳性对照。通过氨基酸连接器分开直接融合的Rluc和 EYFP蛋白是一个很好的BRET阳性对照。通过克隆没有它的终止密码子上游并且添加EYFP编码序列的萤光素酶编码区来准备。然后添加腔肠素到细胞中表达Rluc-EYFP融合。Rluc的发射光直接转移到EYFP,引起了很高的BRET信号，比较从Rluc和 EYFP或单独的Rluc来获得BRET比率
3. 当检测受体和受体，或者受体-蛋白质相互作用的时候，在BRET实验中，使用阴性对照是重要的。包括分别标记了Rluc或者EYFP和未标记EYFP或Rluc受体的表达，来确定BRET信号在相同的细胞中是否仅仅是由于Rluc和 EYFP的过表达。为了评估受体-蛋白质BRET信号的特异性，添加使用其他标记的受体的阴性对照，在这些对照中，标记受体和感兴趣的受体在相似的水平上表达。另外，非标记蛋白可以和供体和受体BRET融合共转染，来破坏他们之间的相互作痛从而降低BRET信号。这个方法适合来评估依靠标记了Rluc或者EYFP的TRHRs的共表达来获得的BRET信号的特异性。
4. 为了确定在TRHRs中是否发生了相互作用（homo- oligomerization），用Rluc或者EYFP来标记TRHRs的C末端产生TRHR/Rluc 或者TRHR/EYFP （5）。
5. 没有BRET信号并不意味着相互作用的缺乏，也可能意味着供体和受体标记不在一个有利于能量转移的方向。Rluc或者EYFP融合了N或者C末端标记的部分感兴趣的蛋白突出的显示了BRET的重要性。使用这种方法，两种分别带有优化方向和距离融合分子的供体和受体的伙伴蛋白的相互作用的组合可以给出更灵敏的BRET信号，可以被确定。在感兴趣的融合EYFP或Rluc的蛋白质之间插入氨基酸连接器序列可能是有用的。当执行BRET来检测受体-蛋白之间的相互作用，受体一般标记在C末端而不是N末端来增加正确折叠和受体膜定位，减少与配体结合干扰的机会。
6. 与非标记蛋白相比，可以评价BRET融合蛋白的功能，当有可能，在使用BRET方法之前。另外，添加Rluc或者EYFP到受体或者感兴趣的蛋白可能干扰表达，折叠，定位 或者蛋白质功能，在评估潜在受体相互作用的相关性前，确定标记蛋白的功能是否受损是非常重要的。为了评估BRET受体融合结构的功能，需要在receptor/Rluc和receptor/EYFP融合子与非标记受体进行比较来进行受体结合和信号实验（5）。相互作用的蛋白（β-arrestin）受体的特性将决定采用何种实验来评估特定感兴趣的蛋白的功能是否保留。在β-arrestin作为感兴趣的蛋白的情况下。β-arrestin/EYFP或Rluc的融合功能进行评估用1）受体内部化试验来测量促进GPCR内部化的能力。2）共聚焦显微镜来监测β-arrestin/EYFP的配体依赖性易位（5）。在转然后48小时，通过使用Mithras LB940 多功能酶标的发光模块测量发光来评估Rluc标记蛋白的表达水平，通过使用Mithras LB940 多功能酶标的荧光模块或者带有荧光活性的流式细胞仪测量荧光来确定EYFP标记蛋白的表达水平。
