Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒使用说明书
中文名称：Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
英文名称：AlamaBlue Cell Viability Assay Kit
产品规格：500T
AlamaBlue 细胞活力检测试剂盒提供了一种可靠、灵敏、安全和低成本的快速有效检测细胞活力与毒性的方法。AlamaBlue
通过在细胞生长的培养基中所产生的化学还原反应，将非荧光信号的染料转换成为一红色荧光物质，试卤灵（9-羟基-3-异吩恶嗪酮7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮），从而检测细胞的存活率。维持细胞生产需要还原性环境而抑制生长则表现为氧化型环境。细胞生长率相关的降低可表现为氧化还原指示剂从氧化型（非荧光素、紫色）转为还原型（荧光素、红色）。该荧光信号可以用530~560nm
的激发波激发，在590nm 处可以获发射波，检测570 和600nm 的的吸光度值，校正监测值，可以减去相应的570nm 和600nm
的背景吸光度值。检测所产生的荧光信号是与样品中的活细胞数成正比的。
AlamaBlue 细胞活性检测试剂盒的灵敏度相似于[3H]胸苷法检测细胞增殖法。根据不同类型的细胞，AlamaBlue
可以检测到至少40个细胞，同时保证很好的重现性和灵敏度。作为试卤灵（紫红、红色荧光）可以进一步被还原为水解化的试卤灵（无色、无荧光），当细胞数量增多，所有的刃天青（7-羟基-3-羰基-10-氧化-三氢吩恶嗪）被转换为试卤灵（9-羟基-3-异吩恶嗪酮7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮），试剂盒的信号反而会发生衰减。因此，对于您所用的试剂盒来说，针对不同的细胞类型，应该调整您的细胞数，做相应的优化，才能得到更好的结果。
操作说明
以下操作可用作通用指导建议。考虑不同细胞类型与培养条件的差异性，有必要根据实际情况优化您的操作步骤。
1. 96 孔细胞培养板每孔100μL 培养基饲养细胞，控制细胞数目在40~10000 个/贴壁细胞，2000~500000 个/悬浮细胞。设置空培养基做对照。
2. 加入10μL AlamaBlue 溶液至培养基中，37 度孵育：24 小时（比色法读数）；5-6 小时（荧光读数）。
3. 检测570nm 和600nm 的吸光度，或者用荧光微孔板读数530nm 激发，590nm 发射波读数。
4. 如果采用比色法检测，选择OD570-OD600 检测，如果检测荧光信号，请在校正OD 值后，先设置标准曲线，选择合适您实验的细胞最佳浓度。
Alarma Blue细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒注意事项：
1、悬浮细胞用此法时必须经离心后才能吸出上清再加DMSO。
2、Formazan 的生成不仅与活细胞数成比例，也受作用时间的影响，因此当样品较多时测定的OD 值可能随时间而变。
3、MTT 溶液为黄色，需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。MTT 溶液在4℃或较低温度情况下会凝固，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
操作规程
1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃
5%CO2细胞培养箱培养24小时.
2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。
3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。
4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。
5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。
6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。
7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。
8、结果分析
a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（完全培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD
值（完全培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD
值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100
b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)
