利用遗传学手段描绘果蝇化学连接组
最近十年，在神经科学领域被科学家提到频率最高的词汇中，“神经环路”绝对榜上有名并且排名很靠前。有关神经环路的研究因为技术的进步而变得可解决(do-able)， 也因此成为当下最热门, 最具活力的研究领域之一。
最早的神经环路研究，大概源于人们开始思考如何判定大脑怎样指导行为，产生意识。其中比较著名的大概是维也纳医生Franz Joseph Gall。基于对病人颅骨形状的观察他发展出颅像学这门伪科学。虽然现在我们知道这样的判断依据是错的，但是却诞生了”脑区功能分工”这一思想。后来Broca 区以及Wernicke区受损病人语言功能障碍的症状为语言功能环路奠定了重要的基础，也为大脑功能分区提供了重要的佐证。此后的Broadmann map 以及Penfield的一张著名的cortical homunculus图也是脑功能分区的里程碑。而神经元学说的普及以及突触的发现更进一步提升了对研究环路分辨率的要求: 具体而言就是神经元甚至亚细胞之间的连接如何，以及这些连接如何与特定行为产生联系。
Brodmann map。来源于：https://en.wikipedia.org/wiki/Brodmann_area
cortical homunculus。图片来源于：https://www.sciencenewsforstudents.org/blog/scientists-say/scientists-say-cortical-homunculus
目前根据神经元自身的特性研究神经环路主要分为互相联系的两种类型: 功能性和结构性神经环路研究。
功能性神经环路如: 研究功能性神经环路笔者首先想到的就是fMRI, PET, 这些技术可以对活体大脑的活动进行实时监测，可以快速获得全面的信息。不足之处在于受其分辨率的限制只能看到一些脑区的活动, 至于脑区里的哪些细胞在发挥功能则不得而知。在细胞水平监测神经环路则可以采用电生理学的方法，通过记录在受到刺激前后的细胞的电活动来确定是否存在神经连接，结合药理学手段甚至可以判断这种连接是否发生在单突触水平。这种方法的缺点是每次只能观察少量的细胞。在细胞水平上进行较大规模的神经活动监测，可以使用对钙离子敏感的染料，这点要归功于化学生物学家Roger Tsien。通过对BAPTA和 EGTA进行改造， Roger Tsien 使这些钙螯合剂变成了钙指示剂【1】。进一步改进后，他还发明了fura2 以及后续一系列信号更强的指示剂【2】。之后他实验室利用钙敏感的FRET开发出对钙敏感的工具蛋白质使得遗传水平标记细胞成为可能【3】。基于类似的原理（CaM和M13），2001 年日本科学家开发出新的对钙敏感蛋白质GCaMP【4】。2005年及以后发表的光学遗传学技术使得直接体外和体内操控神经元成为可能，对功能性神经环路图谱的绘制起到关键性的推动作用【5-7】，揭开可神经环路研究的新篇章。
在实际应用中，光遗传学技术需要借助病毒或转基因技术来实现对特定核团或者细胞类型的操控，因此对于特定的细胞亚型并不是很方便。此外，最近开发的GCaMP6以及其它钙信号感受荧光蛋白和电压敏感的探针则可以使空间分辨率达到细胞甚至亚细胞水平, 正在各个领域的研究中被广泛使用【8, 9】。北大李毓龙老师和加州大学Lin Tian 老师最近开发的基于神经递质受体构象变化而产生荧光的神经递质受体探针，则可以监测受到某种特定刺激之后的细胞活动，为功能性神经环路的mapping提供了另一个角度【10-12】（NBT | 北大李毓龙组开发新型乙酰胆碱荧光探针——专家点评；Cell丨李毓龙组开发新型多巴胺荧光探针——仇子龙点评）。并且利用神经递质来检测神经活动还有一个好处是可以在了解特定的功能之后直接给药.
神经环路的另一个重要方面结构性神经环路，主要是描述脑区之间或者神经细胞之间固有的物理联系。分辨率最高的显微镜是电镜，目前神经细胞之间连结完全搞清楚的线虫就是通过电镜描绘的【13】。然而正是由于电镜分辨率高， 数据的采集，重构都需要花费大量的时间和计算方法，因此通量和效率就是一个问题。这一点从利用电镜研究神经环路的权威Jeff Lichtman 发表文章的情况可以略知一二, 不过,Jeff 已经功成名就，期待他们有更多的数据库出来供大家参考。另外一个方法就是利用病毒或各种示踪染料进行顺行和逆行标记，这种方法通量比较高，实验需要的时间也比较短，因此目前使用较多，最近尤其常见于各种神经科学环路mapping 的工作中。在使用改造病毒进行示踪比较有效的实验室包括Salk 研究所的Ed Callaway，Stanford 的骆利群实验室，Janelia 的Alla Karpova 实验室, 使用顺行标记的如USC的Li Zhang，Columbia 的 Thomas Jessell ， Caltech的David Anderson等。因为实验的具体需要，目前逆行标记的使用更为广泛。 这方面的研究已经有很多文献可以参考【14】，读者可以自行查阅。病毒注射示踪的短板在于对注射的一致性要求很高。如果需要标记特定的细胞类型，需要使用转基因工程鼠或者多次注射。如果对分辨率的要求再低一些，则可以使用DTI观察核团或脑区之间是否存在神经纤维连接。
2月21日，北京大学饶毅课题组一项发表在Neuron题为Chemoconnectomics: Mapping Chemical Transmission in Drosophila的研究中，研究人员利用另外一种方法对果蝇的神经元进行遗传标记：即标记神经递质转运体或者其合成酶，以及神经调质及其受体。
化学传递是神经系统信号传递的主要方式(当然电传递也非常重要), 因此神经递质/调质的调节机体功能的重要性不言而喻。这里基本上可以说“化学是你，化学是我”。研究者选取了193个基因进行操控：以荧光蛋白RFP编码序列代替这些基因的几乎全部编码区从而实现基因敲除，同时在置换载体上加上attP位点方便后续的BP-反应以加上其他的操控元件。这样一来就可以有某个递质相关基因的敲除品系和该基因的报告系统(reporter)，进而分别进行基因功能的研究以及对表达该基因的一群细胞功能的研究。
利用这一原理他们可以观察产生某一种神经递质的细胞的分布和投射； 观察到一种或多种递质和调质受体/合成酶表达的细胞类型，比如octopamine 2受体在神经细胞和胶质细胞都有表达，有些神经递质可以在一个同一个细胞里释放，但谷氨酸转运体和-氨基丁酸合成的谷氨酸脱羧酶则没有重合。有了突变体库就可以做功能性筛选，为此他们筛选了对果蝇睡眠有较大影响的突变体，并发现了 一些有意思的现象。比如速激肽的突变体睡眠受到影响，而人为激活或抑制表达速激肽的细胞却对不影响睡眠, 说明环路的复杂性(兴奋性和抑制性神经元都被激活或抑制)，如果速激肽的表达谱不限于兴奋性可调节的神经系统，也有可能是神经系统之外的速激肽在发挥调节睡眠的功能。此外他们还发现胶质细胞和神经元中的octopamine 2受体都能够调节果蝇的睡眠。他们还发现了通过多巴胺受体调节果蝇睡眠的神经元类型。
有的研究开放型的，比如一项遗传筛选，往往会带来许多突变体，后续也会通过这些突变阐明很多生物学问。另一种是 close the end, 其中也不乏好的研究，比如能为某些问题下定论的。我认为本文是一项开放型的研究，期待后面有更多的工作从这些突变体中产生。
读饶老师的文章总能看到饶老师旁征博引，在这篇文章里饶老师引用了Otto Loewi, Henry Dale和John Eccles的文章。而且我相信Introduction里的那一句也不会“escape readers’ notice”。
参考文献1 Tsien, R. Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures. Biochemistry 19, 2396-2404 (1980).
2 Grynkiewicz, G., Poenie, M. & Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 260, 3440-3450 (1985).
3 Miyawaki, A. et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, 882-887 (1997).
4 Nakai, J., Ohkura, M. & Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol 19, 137-141, doi:Doi 10.1038/84397 (2001).
5 Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G. & Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience 8, 1263-1268, doi:10.1038/nn1525 (2005).
6 Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S. & Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat Methods 3, 785-792, doi:10.1038/nmeth936 (2006).
7 Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A. & Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci 10, 663-668, doi:10.1038/nn1891 (2007).
8 Chen, T.-W. et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature 499, 295-300 (2013).
9 Peterka, D. S., Takahashi, H. & Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron 69, 9-21 (2011).
10 Patriarchi, T. et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science 360, 1420-+, doi:ARTN eaat442210.1126/science.aat4422 (2018).
11 Jing, M. et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol 36, 726-737, doi:10.1038/nbt.4184 (2018).
12 Sun, F. et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell 174, 481-496 e419, doi:10.1016/j.cell.2018.06.042 (2018).
13 White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. & Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 314, 1-340, doi:10.1098/rstb.1986.0056 (1986).
14 Callaway, E. M. & Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. J Neurosci 35, 8979-8985, doi:10.1523/JNEUROSCI.0409-15.2015 (2015).
