光谱移液器与光纤分光光度计用于DNA/RNA定量检测
摘要 在紫外光及可见光光源下,用光谱移液器(WPI-SPT-2)在光纤分光光度计(TIDAS-1)中测量溶液中DNA的浓度(31µg/mL和144µg/mL)。由于只有1厘米光程,借助光谱移液器的使用不需要在此浓度范围内进行测量前的稀释,因此可以消除潜在的误差。由于光谱移液器设计小巧,可以在标准的200µL的PCR小管内对10µL的样本进行常规检测,甚至如果在PCR小管中对电极的尖端位置足够小心,像5µL 这样小的样本都可以重复测量。 实验过程 DNA的标准溶液(Sigma D1626)通过重力方法应用18.2MΩ/cm超纯水作为溶剂来制备,标准溶液的浓度在0.0µg/mL和143.9µg/mL 之间。应用光谱移液器对一式三份溶液进行测量,并将光谱移液器连接到装配紫外及可见光光源的光纤分光光度计上。数据在仪器全波段范围内(190nm-720nm)每增加1nm收集一次,仪器必须对产生总量80%吸光度的溶液进行测量,所有测量使用18.2 MΩ/cm超纯水作为参考溶液。 结果 实验结果如下表 Table 1: DNA 浓度和吸光度值
DNA [µg/mL] | 260 nm吸光度 [AU] |
0.00 | -0.0061 ± 0.0001 |
30.83 | 0.5745 ± 0.0011 |
56.59 | 1.0309 ± 0.0020 |
85.49 | 1.4497 ± 0.0016 |
115.66 | 1.7170± 0.0025 |
143.94 | 1.8280 ± 0.0006 |
因为吸光度与浓度关系遵循Beer-Lambert定律,也即: A= εlc
预期的吸光度可以从DNA溶液中的浓度计算得来,DNA溶液透光系数ε列为0.020µg/ml*cm。 图1中可以看到通过计算得到的吸光度测量值成一条直线,该线表示在260nm波长时的吸光度测量值。较高吸光度值时,与理论值产生的偏差是由于在光纤分光光度计中散射光干扰的结果。 Figure 1: 吸光度的测量值与理论值 Figure 2: 典型的DNA测量图 (56.6µg/mL)