植物凋亡细胞的形态学观察
一、实验目的
1、掌握细胞凋亡的概念、生物学意义。
2、掌握细胞凋亡与细胞坏死的区别。
3、掌握诱导和观察细胞凋亡的方法。
二、实验原理
(一)概念
凋亡(apoptosis)一词来自希腊语,apo指分离,ptosis指落下。凋亡的原意是枯萎的树叶或花瓣自然凋落。1972年澳大利亚昆士兰大学的kerr等人在许多组织中发现了一种散在的自发的细胞死亡现象,认为这是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡,并首次提出了细胞凋亡的新概念。
多细胞生物在发生、发展过程中,为了保持正常的生理机能,一部分的细胞发生自发性细胞死亡,这种细胞死亡是被细胞内一系列相关的分子所调控,并伴随有典型的形态学改变,这种现象被称为细胞凋亡。
细胞坏死是细胞受到化学因素(如强酸、强碱、有毒物质)、物理因素(如热、辐射)和生物因素(如病原体)等环境因素的伤害,引起细胞死亡的现象。
细胞凋亡和细胞坏死的区别
区别 | 细胞凋亡 | 细胞坏死 |
起因 | 生理或病理性 | 病理性变化或剧烈损伤 |
范围 | 少数散在细胞 | 大片组织或成群细胞 |
细胞膜 | 保持完整 | 破损 |
染色质 | 凝聚在核膜下呈半月状 | 呈絮状 |
细胞器 | 无明显变化 | 肿胀、内质网崩解 |
细胞体积 | 固缩变小 | 肿胀变大 |
凋亡小体 | 有 | 无 |
基因组DNA | 有控降解,电泳图谱呈梯状 | 随机降解,电泳图谱呈涂抹状 |
蛋白质合成 | 有 | 无 |
调节过程 | 受基因调控 | 被动进行 |
(二)生物学意义
①清除无用的、多余的细胞。无用的细胞大多在发育早期阶段即发生凋亡。如果发育过程中某些细胞产生过多,也会发生凋亡。例如,人胚胎肢芽发育过程中指(趾)间组织,通过细胞凋亡机制被清除而形成指(趾)间隙。
②清除受损、突变或衰老的细胞。受损不能修复的细胞通过凋亡而被清除。受病毒感染的细胞通过凋亡使DNA发生降解,整合于其中的病毒DNA也随之破坏,阻止了病毒复制。
(三)主要特征
凋亡细胞的主要特征是:①染色质聚集、分块、位于核膜上,胞质凝缩,最后核断裂,细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体;②凋亡小体内有结构完整的细胞器,还有凝缩的染色体,可被邻近细胞吞噬消化,因始终有膜封闭,没有内溶物释放,故不会引起炎症;③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质,但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止;④核酸内切酶活化,导致染色质DNA在核小体连接部位断裂,形成约200bp整数倍的核酸片段,凝胶电泳图谱呈梯状;⑤凋亡通常是生理性变化,而细胞坏死是病理性变化。
三、实验试剂与器材
1、洋葱内表皮细胞
2、染色液(改良苯酚品红染液):
原液A:取3克碱性品红溶于100毫升70%酒精中,此液可以长期保存。
原液B:取A液10毫升加入90毫升5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周内使用)。
原液C:取B液55毫升加入6毫升的冰醋酸和6毫升38%的甲醛(可长期保存)。
染色液:取C液10-20毫升,加入90-80毫升45%醋酸和1.5克山梨醇。
3、0.5M GaCl2
4、光学显微镜、电炉、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片
四、实验步骤
1、材料准备
取新鲜洋葱室温下于清水中培养数小时,使其活化。
2、洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的诱导
从培养好的洋葱鳞茎上切取1 cm2 左右的内表皮,分成三组:
第一组是正对照,为正常细胞;
第二组是试验组,取10 片洋葱内表皮,于0. 5 M CaCl2 中培养10hr;
第三组是负对照,为煮沸5 min 的坏死细胞。
3、细胞凋亡的染色与观察
上述三组材料采用改良苯酚品红染液染色,20 min 后制片。光学显微镜下观察细胞的形态变化。
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