FCM对外周白细胞的免疫荧光分析（一）
外周血是临床检验中的重要标本。FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。近年来，由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现，以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现，使得利用FCM的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息，这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。本节 主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技术、数据分析及临床应用等方面的问题。
一、白细胞的免疫荧光标记技术
1．白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞（见表10-2）。
表10-2 WHO对白细胞分化抗原的命名
| 抗原 | 分子量 | 单克隆抗体 | 反应阳性细胞 |
| CD 1 | P45/12 | Leu 6 ,T 6 ,OKT 6 | 胸腺细胞、朗格罕细胞 |
| CD 2 | P50 | Leu 5 B,T 11 ,OKT 11 | E玫瑰花受体、T和NK细胞 |
| CD 3 | P19-29 | Leu 4 ,T 3 ,OKT 8 | T细胞 |
| CD 4 | P55 | Leu 3 ,T 4 ,OKT 4 | 协助—诱导T细胞，单核细胞 |
| CD 5 | P67 | Leu 1 ,T 1 , T 101 | T细胞、B细胞亚群，慢粒（淋巴性） |
| CD 6 | P120 | T 12 | T细胞 |
| CD 7 | P41 | Leu 9.3 A | T，T—ALL a 和NK细胞 |
| CD 8 | P32-33 | Leu 2 ,T 6 ,OKT 8 | 抑制-细胞毒T细胞、NK细胞 |
| CD 9 | P24 | BA-2 | 淋巴细胞白血病相关抗原 |
| CD 10 | P100 | CALLA, J 5 | 粒细胞、前B白血病细胞 |
| CD 11 | P170/95 | CR 3 /Leu 15 ,OKM 1 | 单核细胞、粒细胞、NK细胞 |
| MO 1 | T细胞亚群（C 3 bi受体） | ||
| CD 15 | LNFP-I | LeuM 1 | 单核细胞、粒细胞、激活的T细胞 |
| CD 16 | P50~70 | Leu 11 | NK细胞、粒细胞（IgGFc受体） |
| CD 19 | P95 | Leu 12 ,B 4 | B、CLL b 前B-ALL细胞 |
| CD 20 | P35 | Leu 16 ,B 1 | B细胞 |
| CD 21 | P140 | CR 2 ,B 7 | B细胞、C 3 a受体细胞 |
| CD 22 | P135 | Leu 41 | B、CLL、和毛细胞白血病细胞 |
| CD 23 | P45 | Blast 2 | |
| CD 24 | P45，P55 | BA-1 | B、CLL和前B-ALL细胞 |
| CD 25 | P65 | IL-2受体 | 数分裂因子激活的T细胞HTLV-I、II、感染细胞 |
a：急性淋巴细胞性白血病；b：慢性淋巴细胞性白血病。
2．样品的制备供FCM分析的样品是单细胞悬液，而且大部分样品都需经荧光染色。样品的制备方法大致有三种：①用荧光单克隆抗体染全血，随后溶解红细胞；②红细胞溶解后染色；③通过梯度离心法分离出单个淋巴细胞和单核细胞，再将之制成细胞悬液染色。
（1）全血染色后溶解红细胞：由于不少血液标本具有生物危害性，用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行，这样减少转换过程中的污染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节 省时间。由于此法未将粒细胞去除，故在用FCM分析时，要注意排除粒细胞的干扰。
具体操作步骤如下：
①全血100～150μl，放入5ml试管，并用50～100μl PBS稀释，总体积为200μl。]
②荧光标记的单克隆抗体染色30min，4 ℃ （或放于冰上）。单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大，但为了使用方便，可按其说明书配成每次实验使用10μl。注意蔽光。
③用3～4μl冷BPS清洗。离心250×g（约每分钟1500转），5min，洗3次。注意每次用吸管将上清吸出，决不能倾倒去液！
④用2ml氯化铵液（配法见下）在室温下溶解红血球，约10min。若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏，或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。若溶解不彻底，大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近，在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。
【氯化铵液的配制】
Tris—氯化铵1×氯化铵
0.16mol/L NH 4 Cl 0.38g/100ml 90ml 0.16mol/L NH 4 Cl
0.17mol/L Tris 2.06g/100ml 10ml 0.17mol/l Tris
pH值7.56 pH值7.2
⑤红细胞被彻底溶解，加入1ml PBS稀释的0.5%甲醛，立即离心，洗3次，条件同步骤③。加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原，避免有生物危害的标本到处污染。
⑥将染色完成的细胞悬浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液内。置4 ℃ ，蔽光，等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周，这样对工作的安排会带来方便。
