拟南芥的转化
实验概要
本实验采用花浸泡法利用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥。
主要试剂
YEB液体培养基，LB培养基，0.1 M CaCl2，0.05 M MgSO4，花浸泡缓冲液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 )，Rif，Kan
主要设备
摇床，离心机，培养钵，温室，托盘，塑料薄膜
实验材料
已构建好的表达载体，拟南芥
实验步骤
1. 农杆菌感受态细胞的制备和转化
1) 挑取GV1301单菌落于10 ml YEB或者LB液体培养基中，28℃振荡培养至对数晚期；
2) 取0.5 ml菌液加入50 ml新鲜YEB或者LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600=0.5；
3) 转移至50 ml离心管中，冰浴20 min；
4) 转移至50 ml离心管中，冰浴20 min；
5) 4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体；
6) 沉淀用8 ml预冷的0.1 M CaCl2和0.05 M MgSO4重悬；
7) 4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体；
8) 取200 ul感受态细胞，加入0.5 ug质粒，轻轻混匀；
9) 液氮冷冻50 s，冰上放置40 min，42℃热激90 s；
10) 加入800 ul LB培养基，28℃恢复培养1 hr；
11) 涂布适量的细胞于筛选培养基上，超净台吹干表层液体；
12) 28℃培养两天。
2. 花浸泡法转化拟南芥
1) 接种含有表达载体的农杆菌克隆于5ml YEB培养基(含100 ug/ml Rif，100 ug /ml Kan)中，28℃，200 rpm，振荡培养过夜；
2) 按1：50的比例转接到200 ml YEB培养基中28℃，200 rpm培养5 hr；5000 X g，离心15 min，收集菌体；重悬于花浸泡缓冲液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 03%Silwet L-77 )，调OD600至0. 8。
3) 将拟南芥培养钵倒置于装有花浸泡缓冲液的合适大小的容器上，浸泡3-5min，取出培养钵倒置于托盘中，用塑料薄膜覆盖托盘，24 hr后取下薄膜，于温室中继续培养。
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精英视角
