分子克隆技术(质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应...-2
PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：
1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可。
2、长度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有时引物长些，但太短会影响引物的特异性。
3、方向：设计出的引物永远是5'-3'方向,所以正向引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向引物则与这股模板DNA序列相互补。
4、酶切位点：如果想克隆所放大的DNA片段，通常在引物的5'端设计适当的限制性酶切位点，使进一步的克隆工作更容易。一对引物可用一种或两种酶切位点，这取决于设计者，两种不同的酶切位点使克隆具有方向性。
5、启始和终止密码：如果想表达所放大的DNA片段，所用的克隆载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在引物的酶切位点之后，特异性DNA序列之前。
6、其它：如果表达的融合蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。【易生物——找仪器、试剂、服务，尽在易生物 www.ebioe.com】
（三）连接反应
将载体质粒DNA和外源基因DNA在DNA连接酶的作用下，双链DNA片段相邻的5'端磷酸与3'端羟基之间形成磷酸二酯键，形成重组质粒，这是分子克隆技术的核心步骤。在连接反应进行之前，质粒和外源基因DNA分别用同样的限制性内切酶消化，使它们成为含有同样粘性末端或钝端的线性DNA，这是连接成功的先决条件。下面介绍连接反应的程序。
1、模板DNA的准备
在进行DNA重组以前，通常要先将DNA分子用限制性内切酶消化，使两种DNA分子的末端产生相同的粘性末端或平齐末端。通常按下列比例进行：
1. 双蒸溜水 适量
2. 10× 酶缓冲液 1/10容量
3. DNA 多少μl
4. 限制性内切酶 1/10容量（每微克DNA用1-10单位）
总容量（根据DNA分子量来确定，通常10-100μl）。
混合后37℃温育30-120min。
2、连接反应
在DNA连接酶的作用下，将外源基因DNA片段和线性质粒DNA连接起来构成重组质粒的过程。通常按下列比例进行：
1. 双蒸溜水 适量
2. 10× 酶缓冲液 1/10容量
3. 质粒DNA 适量
4. DNA插入片段 适量
5. 限制性内切酶 1/10容量(每微克DNA用1-10单位)
总容量（根据DNA分子量来确定，通常10-20μl）。
混合后置14-16℃水浴6-12小时。
[注意]
通常DNA插入片段的量是载体DNA的3倍，这需根据DNA分子量计算，而不取决于浓度。
（四）重组质粒的转化
DNA插入片段和质粒DNA在体外连接形成重组质粒后，需要被导入到细胞内才能进行扩增和表达。接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞）。原核细胞即可作为基因复制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；真核细胞一般用作基因表达系统。
一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化（transformation），而将重组DNA分子导入真核细胞的过程称为转染（transfection）。
1、感受态细胞的制备
未经处理的大肠杆菌很难受纳重组DNA分子，但当将大肠杆菌用物理或化学方法处理后，细胞对摄取外来DNA分子变得敏感了，这种经过处理而容易接受外源DNA分子的细胞叫做感受态细胞（competent cell）。
将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使DNA分子进入大肠杆菌细胞中，实现了重组DNA分子的转化。
受体细胞是重组基因增殖的场所，对受体细胞也应具有几个要求：
（1）容易接纳重组DNA分子；（2）对载体的复制扩增无严格限制；（3）不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；（4）不对外源DNA进行修饰。
由于载体的不同，所具备的筛选标志不同，所用的受体细胞也不同，因此可根据所用的载体选择合适的受体细胞。
将大肠杆菌放入低渗的CaCl2溶液中，使细胞处于膨胀状态，从而获得大肠杆菌感受态细胞，4℃可保存1-2周，若需长期保存，可加甘油至终浓度为15%，置-70℃备用。
2、转化
将重组质粒置于感受态细胞溶液中，使重组质粒吸附于感受态细胞的表面，冰浴一段时间，细胞膜处于收缩状态。然后迅速将感受态细胞置于42℃，使细胞在热环境中膜通道开放，重组质粒由膜外高浓度区向膜内扩散，经过45秒时间后，再将感受态细胞放回冰浴中，膜通道关闭，重组质粒转入大肠杆菌。
3、转化细胞的筛选和菌株的保存
（1）转化细胞的筛选
作为载体的质粒都含有一种或两种抗生素的耐药基因，当把这种质粒转入大肠杆菌后，此菌便获得了抵抗这种抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素的耐药基因，所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素加入培养基中后，只有含质粒的细菌能够生存,而不含质粒的细菌则死亡。
另外，在某些质粒中含有LacZ基因，多克隆酶切位点位于LacZ基因内部，当没有外源基因插入LacZ基因中时，LacZ基因的启动子可使此基因编码半乳糖甘酶，从而催化底物X-gal发生化学反应，菌落变成蓝色；当外源基因与质粒发生连接时，LacZ基因失活，菌落呈白色，同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因，根据此特性，白色菌落含有重组质粒。
（2）质粒和菌株的保存
质粒可以在-20℃冰冻长期保存。
菌株可在含20-50%甘油培养液中-20℃或-70℃保存。
