Western Blot实验操作中的缩短数据差异的应对方法
做Western Blot的小伙伴，你是不是还在那里熬夜赶实验？是不是还在纠结今天的结果怎么和昨天的差异这么大？是不是在为选择哪种检测方法而烦恼？在为实验的重复性而抓狂？今天小编就和大家聊一下Western Blot中遇到的问题以及应对方法。
归一化问题：
做Western Blot经常需要对蛋白进行归一化，经典的归一化方法是看家蛋白归一化，看家蛋白需要选择在不同样品间稳定表达的蛋白；其次表达丰度也需要筛选，如果丰度过高，目的蛋白丰度与看家蛋白差异过大，那两者检测定量时就不在一个线性范围。这样的筛选过程非常耗时耗力。即使筛选到合适的看家蛋白，对其归一化的过程也需要多次重复调节才可以。
检测灵敏度问题：
小编做Western Blot检测时，由于目的蛋白含量低经常曝光不出来，同时老仪器检测灵敏度不够高，只能不断调整实验，提高上样量，再反复进行摸索，做Western 做到怀疑人生。
蛋白定量重复性问题：
Western Blot检测时，化学发光依赖酶活性和底物浓度，发光信号不稳定，因此定量时容易出现误差，重复性相对较差，也只能不断实验来进行调整和验证。
多个目的蛋白检测问题：
Western Blot检测时，有时需要对多个蛋白进行检测，这时的实验就会变的繁琐，需要对每一个蛋白进行表达检测，剪膜，剥离膜经常要做，但是经过这些步骤又会影响定量的精准性，小编也很为难。
那么上述问题有没有好的解决方法呢？这里悄悄告诉大家一个好消息，采用Sapphire双模式多光谱成像系统，可以很好的解决上述困扰，好文章也在向你招手。
Sapphire成像系统采用双模式，既有扫描式又有CCD成像式；多达四激光激发用于荧光成像，每个通道配有自己独立的检测器，PMT检测器用于蓝光成像，3个APD检测分别用于绿光、红光和近红外检测，高分辨率CCD用于化学发光检测，在全光谱范围内避免信号损失；动态范围可达6log；软件操作简单，易于上手。
应对均一化问题，已有众多期刊建议采用总蛋白均一化，总蛋白均一化能够更加真实的反应目的蛋白表达量的变化，同时也无需繁琐的筛选看家蛋白、调整蛋白上样，只需对总蛋白进行染色和调整，Azure提供总蛋白归一化试剂和相应的AzureSpot分析软件，轻松搞定蛋白均一化问题 。
应对低丰度蛋白检测问题，Sapphire双模式多光谱成像系统可以加配610万像素，大光圈的优质CCD检测器，其检测灵敏度可以达到fg级，动态范围是传统胶片的4倍。可以进行累积曝光，可以快速得到你需要的图像，无需多次重复和改变上样。
应对重复性问题，荧光检测方法与传统的化学发光不同，荧光检测方法不依赖酶活性和底物，二抗标记荧光基团，信号强度和上样量成线性关系，信号持久，可以得到更好的重复性结果，实验可以快速完成。
应对多种蛋白检测问题，荧光检测的一个好处是，无需剥离和重孵育，即可在一张印迹膜上进行多种蛋白的检测，减少蛋白变化的误差，实现精准定量。
