血液病的分子生物学检查及其应用
血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、转基因技术及基因芯片（DNA-chip）技术等分子生物学技术。目前，这些技术在血液学检验领域已得到广泛应用，如应用于血液病基因分析、基因诊断、白血病分型、指导治疗、判断预后和微小残留病检测等方面。随着分子生物学技术的进一步发展，血液病的基因表达和治疗、细胞之间和细胞内的信号传导、特异的血液病基因或融合基因的检测及应用将成为当代血液分子生物学检验的主要内容和方向。本节将介绍几种常用的血液分子生物学技术。
一、核酸分子杂交技术
(—)Southern印迹杂交
Southern印迹杂交（Southern blot
hybridization）是一种常用的分析DNA结构的核酸分子杂交技术。其原理是将待测的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，凝胶经碱处理使DNA变性，再将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带，对待测DNA进行分析。
(二)Northern印迹杂交
Northerm印迹杂交（Northern blot
hybridization）和Southern印迹杂交的过程基本相同，区别在于靶核酸是RNA而不是DNA。待测RNA经变性及琼脂糖电泳分离后，按大小不同而相互分开，随后将其转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后用DNA或RNA探针杂交，按探针的标记特性对杂交信号进行检测，对待测RNA进行分析。
（三）核酸原位杂交
以放射性或非放射性标记的DNA或RNA探针在组织、细胞及染色体上与其相关的核酸序列杂交，简称原位杂交(in situ
hybridization)。原位杂交的原理是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法，在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。此项技术是在保持细胞，甚至单个染色体形态的情况下完成的，因此通常用于检测染色体的异常改变、肿瘤致病基因和肿瘤微小残留病的检测等。
二、聚合酶链反应
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术于1985年由美国Mullis等建立。PCR技术使体外扩增核酸片段成为可能，使人们能够在几小时内从试管中获得大量特异核酸片段。由于核酸是生物体储存和传递遗传信息的载体，因此能够迅速获得大量特异核酸片段的PCR技术给生命科学各个领域的研究手段带来了革命性的变化。该技术已经与DNA克隆、DNA重组和DNA测序等技术一样成为血液分子生物学一项不可缺少的工具。PCR技术的重要性在于能在体外快速、高效地从复杂DNA中特异地扩增目标DNA。其主要优点是：①快速简便，设备要求低，一般扩增几小时即可完成。②高度敏感，样本量极小，甚至能用单个细胞进行基因分析，大大提高了基因诊断的灵敏度和准确性。③样品适应范围广。④PCR产物的分析主要采用凝胶电泳的方法，大大推动了非放射性基因诊断技术的发展，便于推广。
（一）PCR技术的原理和反应过程
PCR是一种在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA的复制相似。是一种模拟天然DNA合成过程的选择性体外扩增方法。每一次复制反应分三个步骤即：①变性（denatoration）：在加热条件下，DNA变性，螺旋解开。②退火(annealling)：在退火条件下，引物与模板DNA结合。③延伸(extension)：在耐热DNA聚合酶(Taq
DNA
polymerase)4种脱氧核糖核苷三磷酸底物(dNTP)、镁离子及合适PH值的缓冲液条件下，聚合酶催化以引物为起始点的5’→3’DNA链延伸反应，把基因拷贝数由2个增至4个。在反应的初期原来的DNA担负着起始模扳的作用，随着循环数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。重复上述过程25~30个循环，就可把基因拷贝数以指数形式增加至上百万倍，从而达到体外扩增核酸序列的目的。
（二）PCR反应的基本条件及循环参数
1．PCR反应的基本条件
（1）模板 模板就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。
传统方法提取制备的DNA样本均可直接用于PCR，如基因组DNA、cDNA，若起始材料是RNA，先通过逆转录得到第一条cDNA，再进行扩增，即所谓的逆转录PCR(RT-PCR)。也可用细胞变性提取液直接进行扩增以及用陈旧血斑提取DNA用于扩增。但不管标本来源如何，模板都需纯化，使其不含蛋白酶、核酸酶、Taq
DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白质等。
（2）引物
引物是决定PCR结果的关键，其决定PCR扩增产物的特异性和长度。引物的合成一般是在已知序列的DNA某个区的上、下游合成两个与其两股链3’端互补的寡核苷酸，一般长度为15~30bp，G+C含量约50％。应尽量避免数个嘌岭或嘧啶的连续排列，避免引物内部形成二级结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，避免形成“引物二聚体”。引物浓度不宜过高，否则易形成引物二聚体，或者是容易产生非特异性产物。目前引物大多已商品化。
（3）dNTP
即dATP、dCTP、dGTP和dTI'P。高浓度dNTP易产生错误掺入，而浓度过低又会降低反应的产量。通常用20~200μmol/LdNTP，不能低于10~15μmol/L。4种三磷酸脱氧核苷的浓度必须一致，四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。DNTP的PH值也很重要，一般应调至8.3~8.6。
（4）Taq DNA聚合酶 Taq
DNA聚合酶在70~75℃时具有最高的生物学活性。在92.5℃、95℃、97.5℃下，酶的生物半衰期分别为130min、40min和5~6min。在PCR反应中，变性温度一般为94℃，30s，最长不超过60s，以循环30次计算，Taq
DNA聚合酶可保证PCR反应的需要。Taq
DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，酶的活性对Mg2+浓度非常敏感，合适的KCl浓度和dNTP用量，有利于酶活性的发挥。酶的用量根据扩增片段的长短及其复杂程度(G+C含量)不同而有所区别。
（5）扩增缓冲液 标准缓冲液中，KCl用量为50mmol/L、Tris-HCl用量为10 mmol/L，在缓冲液中加入Taq DNA聚合酶稳定剂如小牛血清白蛋白、明胶、Tween20等，有助于稳定聚合酶。
（6）Mg2+ Mg2+浓度对反应产物的特异性及产量有显著影响。浓度过高使反应特异性降低；使反应产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5 mmol/L较合适。
2．PCR循环参数
（1）变性温度和变性时间 解链不完全是导致PCR失败的一个主要原因。一般来说，94℃ 1min可使起始模板完全变性。
（2）退火温度与退火时间
退火温度与时间应随所用引物的Tm值及扩增片段的长短而调整。一般说来，退火温度比引物的Tm低5℃，退火时间不能少于30s，但也不能太长，否则会引起非特异性退火。Tm=4(G+C)+2(A+T)，此公式仅适用于14~20个碱基的人工合成引物。
（3）延伸温度与时间 引物延伸温度一般在72℃左右，延伸时间应根据扩增片段的长短来调节。正常情况下，每分钟可延伸1kb的长度。
（4）循环数
在其他参数已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。事实上扩增产物的指数累积并不是无限制的。随着循环数的增加，引物和dNTP大量消耗，酶的活性也下降，退火时模扳互补链之间的复性也逐渐增加，扩增效益下降，扩增产物从指数形式增长逐渐恢复为线性形式增长。一般取20~30个循环数。
（三）PCR产物分析
PCR产物检测方式有多种，常用的有凝胶电泳法、斑点杂交法、Southern印迹杂交法、原位杂交法、颜色互补分析法及PCR-ELISA法等。
1．琼脂糖凝胶电泳
是一种简便易行的分离DNA片段的方法。在PH值8.0时，DNA分子带负电荷，在电场中向阳极移动，其移动速率同分子大小成反比，分子越大，在凝胶孔中受到的阻力越大，相反分子越小，在凝胶中移动越快。待分离的PCR产物中要加入溴化乙锭，在紫外灯下观察电泳条带时，溴化乙锭与DNA结合，发出棕红色的荧光。
2．Southern印迹杂交 是基因诊断常用技术之一。将琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物在原位变性，并将变性产物转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后用生物素等标记的探针检测该产物。
3．斑点杂交法
当扩增产物是多条带纹时，可用斑点杂交法分析PCR产物。首先将扩增的片段固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用生物素等标记的探针杂交。或将不同的探针固定在同一尼龙膜上，用标记的PCR产物作探针杂交，根据杂交点的位置即可判断产物序列变异的种类。斑点杂交有助于检测突变DNA的突变类型，有助于遗传病的基因诊断，还可用于基因多态性分析，如HLA基因多态性分析。
4．PCR-ELISA法
待测PCR产物需携带有生物素等固定集团和地高辛等检测集团。PCR反应产物中带生物素标记的引物延伸链与带地高辛标记引物延伸链形成双链，生物素等固定集团可与微孔板上包被的亲和素结合，向微孔板中加入酶标记地高辛抗体和生色底物，即可对PCR产物进行ELISA检测。
5．原位杂交法 PCR产物也可用原位杂交法检测，所用探针可用生物素、地高辛或荧光标记。
三、以PCR为基础的其它相关技术
近年来PCR技术在应用的过程中得到了进一步的发展。目前已出现多种以PCR为基础的PCR相关技术，形成了适用于不同目的的PCR技术系列，以下是几种在血液学及检验领域应用较多的PCR相关技术。
（一）逆转录PCR
逆转录PCR（reverse transcription
PCR，RT-PCR）是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行的体外扩增技术。由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板，因此必须先将总RNA或mRNA作逆转录，生成与之互补的cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需要的目的基因片段。RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探针以及分析基因表达等。
（二）定量PCR
最初的PCR技术只是用于定性检测DNA或RNA，对PCR产物的数量并不重视。随着科学研究的逐步深入，人们开始考虑用PCR技术来进行DNA或RNA的定量检测，随之出现了定量PCR（quantitative
PCR，Q-PCR）技术这一新名词。目前常用的Q-PCR技术可分为终点法和实时法。
1．终点法Q-PCR 所谓终点法Q-PCR是指在PCR结束以后根据最终的PCR产物量来决定模板中目的基因的数量。而根据所用内对照的区别，终点法Q-PCR又可以分为两种。
（1）使用管家基因进行相对定量
在扩增目的基因的同时扩增管家基因（β-actin\GAPDH等），PCR反应结束后将产物通过琼酯糖电泳和EB染色后用密度扫描分别得到各标本的目的基因和管家基因的产物量，最后得到各标本间目的基因数量校正值（目的基因数量/管家基因数量）的差别。此方法一般用于检测一些在不同时相表达差别较大的基因，例如用药前后某基因表达量的改变、某基因在不同组织的表达差异等。这些方法只能得到目的基因的相对定量值，其定量的准确性和精确度都较差，同时受人为因素的影响很大，所以目前已经被淘汰，只用于一些对精确度要求不高的简单实验。
（2）人为设计一种已定量的内参基因对目的基因进行定量分析
一般来说，设计的内参物具有以下特点：①扩增的片段大小和目的基因相似。②扩增的片段中GC含量与目的基因接近，引物的退火温度和扩增目的基因的引物接近。③该内参物已经被精确定量。在进行PCR时，目的基因和内参基因同时扩增，这两种基因在反应体系中存在竞争机制，所以最终目的基因的产物量与内参基因的产物量成反比关系。我们可以通过内参物的量来决定目的基因的量。现在也有研究者在体外构建目的基因的突变子，这样一来可以和目的基因共用PCR引物，简化了实验方法。
由于最终的结果取决于密度扫描的精度，所以终点法Q- PCR分析技术的准确性受到限制，目前已被最新的荧光实时Q- PCR技术取代。
2．荧光实时FQ- PCR技术 近年来发明的荧光定量PCR仪使荧光定量PCR（fluorescence quantitative
PCR，FQ-PCR）技术达到了精确定量的要求。实时FQ-
PCR引入特异的荧光探针技术，该探针与PCR引物对内侧的一段序列同源。探针的5’端标有报告荧光（FAM、JOE），而在3’端标有淬灭荧光（TAMRA）。当探针保持完整时，报告荧光的发射波长被淬灭荧光的激发波长吸收，因此检测不到报告荧光信号。当PCR进行过程中，TaqDNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性可以将荧光探针切成单个碱基，使报告荧光不再受淬灭的影响，使报告荧光的荧光信号可被检测到，并随着PCR循环圈数的增加而增加荧光信号。在实时定量PCR系统中，我们将检测到的荧光信号强度（△RQ）超过基础值10倍的循环圈数定义为循环阈值（cycle
threshold，Ct）。因此当标本中模板拷贝数越多，则Ct越小，而模板拷贝数越少，则Ct越大，达到构建已知标本的目的。针对不同的融合基因，设计特异的荧光探针和引物，PCR扩增后计算校正拷贝数，阳性标本的拷贝数一般大于某一特定的设定值（多次实验的经验值），而阴性标本的拷贝数小于设定值。
Q-
PCR除了可以进行融合基因的定性分析外，最重要的功能是通过监测患者融合基因拷贝数来判断治疗效果和预后情况，以及预报复发的可能。以急性早幼粒细胞白血病患者的定量分析结果为例，如果患者的融合基因拷贝数经过治疗以后呈现持续下降的趋势，则该患者的治疗效果较佳，预后良好，可以获得较长的无病生存期；而如果患者的融合基因拷贝数呈现较大的波动，甚至有上升的趋势，则预示该患者的治疗效果较差，有复发的可能性，需要进行强化治疗以提高缓解率。
（三）多重PCR
多重PCR（multiplex
PCR）即在同一反应体系中加入多对引物，以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段。多对引物间的组合必须满足二个条件，一是将反应条件较为接近的引物组合在一起，以使该反应条件能尽量适合所有被扩增片段，二是同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段分离开。多重PCR比较适用于被检测基因较大，突变点较多的基因。
（四）差异显示PCR
差异显示PCR（differential display
PCR，DD-PCR）是一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。基因在不同组织细胞中的表达不同，在细胞的不同发育阶段和状态中的表达也有差异。研究基因表达谱的变化有助于理解细胞分化、增殖、细胞周期的调节和细胞衰老、凋亡的过程。
（五）原位PCR
原位PCR（in situ
PCR）是指组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶序列进行PCR反应的过程。原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。经脱蜡处理的组织切片或细胞悬液均可作为扩增样品，所有反应在载玻片上进行。原位PCR技术不仅不需要从组织细胞中分离模板DNA或RNA，而且能在细胞原位进行PCR扩增，大大地提高了检测的灵敏度。目前，原位PCR已成为研究靶基因序列的细胞定位、组织分布和基因表达检测的重要手段。
四、 基因芯片技术
基因芯片技术又称DNA微阵列（DNA -
chip）。该技术是二十一世纪生命科学领域广泛应用的一项高效快速的分子生物学技术。DNA-chip是将大量以特定排列方式的基因探针或基因片段固定于硅片、玻片和塑料片上，样品DNA或RNA通过PCR扩增，体外转录等技术掺入荧光标记分子，与微阵列杂交后再通过荧光扫描仪及计算机分析，即可获得样品大量基因序列及表达信息。目前，基因芯片技术主要应用于白血病的免疫分型、细胞的基因表达检测、基因异常检测及单核苷酸多态分析等。
五、分子生物学检查在血液学中的应用
（一）恶性血液病融合基因的检测
白血病染色体相互易位是导致染色体重排的最常见原因。染色体重排在分子水平上常形成融合基因。重组产生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特异性分子标志。融合基因检测对疾病的诊断、分型、治疗方案的选择、预后判断及微小残留病的检测都有重要的意义。
慢性粒细胞白血病(CML)Ph
染色体易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表达一个具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML发病的分子基础。应用传统的Southern印迹杂交法，以BCR为探针，发现所有Ph阳性的CML均有该基因的重组，而多数Ph阴性的CML也有BCR-ABL基因的重组。由于PCR方法灵敏、快速，目前多采用逆转录PCR(RT-PCR)法来检测CML的融合基因，即以待测mRNA
BCR-ABL转录本为模板，用逆转录酶合成BCR-ABL接头部顺序的cDNA，设计扩增引物，经PCR扩增后检测扩增产物。这样只有有关染色体发生易位后才能扩增到产物。目前采用FISH法对染色体原位检测BCR-ABL也是十分有效的。
急性早幼粒细胞白血病(APL)特异性染色体易位是t(15；17)(q22；q21)，易位的结果使15号染色体的PML原癌基因与17号染色体上的维甲酸受体a(RARa)基因融合产生PML-RARa融合基因，亦可通过Southern印迹杂交、RT-PCR及FISH法进行检测。临床上变异型APL（M3v，M3b）与急性粒细胞白血病部分分化型(M2)较难鉴别，M2的t(8；21)可产生一种融合基因AML1-ETO，这种融合基因在M2中的发生率为20％~40％，在M2b中可达90％，通过融合基因的检测可准确鉴别这两种白血病。M3患者有t(15；17)和PML-RARa融合基因者对反式维甲酸(ATRA)疗效较好。也有少数患者无t(15；17)，而有PML-RARa融合。近年来，一些经细胞形态学、细胞化学、免疫组化检测确认为M3的患者，对ATRA不敏感，细胞遗传学检查为t(11；17)或t(5；17)，经分子水平检测分别为PLZF-RARa和NPM-RARa融合基因，或有更复杂的染色体易位。融合基因的检测对治疗方案的选择有明确的指导作用，仍以M3为例，在ATRA和化疗达完全缓解(CR)的M3，自体骨髓移植(ABMT)前PML-RARa融合基因阳性者极易在十个月内复发，而融合基因阴性者，复发率低。
（二）免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体（TCR）基因重排的检测
IgH和TCR的编码基因具有多态性。IgH基因重排是产生个体多样性和独特性的主要原因。由于白血病细胞源于造血干细胞，所以白血病细胞是单克隆性的。用PCR方法对重排基因进行扩增，正常白细胞的扩增产物大小不等，呈模糊的阶梯状，而白血病细胞扩增产物经电泳后条带是单一的。约80%的B淋巴细胞白血病可检测到IgH基因重排。通过PCR方法检测IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴细胞白血病的分型以及微量残留的检测。
（三） 遗传性血液病的诊断
血红蛋白病是常见的遗传性溶血性疾病，血友病是常见的遗传性出血性疾病。基因缺陷包括基因缺失、点突变、插入、倒位等。对于基因重排，可通过RT-PCR进行检测；对于点突变则可用PCR结合酶切位点分析，即当点突变使某一酶切位点消失或在某一区域出现新的酶切位点时，可用该酶切点两侧的引物进行扩增，然后将扩增产物用适当的内切酶切割，根据电泳图谱来判断有无内切酶切点的改变。对于与限制性内切酶点无连锁的点突变，则可采用PCR结合特异寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交法进行诊断。
（四） HLA基因多态性检测
采用PCR扩增产物的反相杂交（斑点杂交）进行HLA基因多态性检测十分简便、有效。将每个位点的所有寡核苷酸探针固定在固相支持物上，引物先经生物素化后，进行待测DNA的基因扩增，从而得到生物素化的DNA放大产物。用此产物与膜上的探针杂交，然后进行显色或化学发光。这样每个样本只需杂交一次即可完成。此方法适合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因与疾病相关性分析等。
（五） 肿瘤细胞多药耐药基因的检测
多药耐药性（multidrug
resistance, MDR）是指肿瘤细胞接触了一种药物以后，不但对该药产生耐药性，而且对其他结构的作用机制不同的药物也产生耐药性。研究发现，MDR的出现常与多药耐药基因（MDR1）过度表达有关，目前已建立Northern印迹法、斑点和狭缝印迹法、RT-PCR法及原位杂交法，从mRNA水平对患者进行测定，了解肿瘤细胞的耐药特性。有研究表明，急性髓细胞白血病MDR1的表达与预后有密切相关，即MDR1阳性者CR率低，生存期短，且易早期复发。
（六） 基因治疗
基因治疗的目的是应用DNA重组技术和基因转移技术，把野生型的基因导入患者体细胞内，成为正常的基因产物，来补偿缺陷基因的功能，从而使疾病得到纠正。目前认为基因治疗的靶细胞是造血干细胞或间质干细胞等。常用的载体是逆转录病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆转录病毒载体转染血友病B患者的原代皮肤成纤维细胞，使其表达一定浓度的因子Ⅸ，这将为血友病B治疗提供新的方法。
