反转录病毒产毒细胞系建立实验
反转录病毒载体导入包装细胞系
测定病毒滴度
培养细胞的Xgal染色
实验材料 | 包装细胞系 |
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试剂、试剂盒 | HEPES CaCl2 甘油 DMSO |
仪器、耗材 | 培养皿 培养板 离心机 |
实验步骤 |
1. 在转染前1天,在10 cm 培养皿中接种包装细胞,接种密度大约相当于10%~20%片的细胞数。
6. 在转染的细胞中加10 ml 培养液,培养2~3天,然后继续步骤10。
7. 在感染前1天,将包装细胞系按1:10至1:20传代。
8. 移去将要感染的包装细胞系的培养液。加病毒如下:用于感染一个10 cm 的培养皿上的细胞,稀释0.1~1.0 ml 毒原液至终体积3~5 ml 并加800 μg/ml 的polybrene至8 μg/ml;如感染一个6 cm 的培养皿,稀释0.1~1 ml 病毒原液至终体积2 ml,并加800 μg/ml 的polybrene至终浓度8 μg/ml 温育1 h。
9. 对于10 cm 培养皿则,加培养至终体积10 ml,对于6 cm 培养皿则加4 ml。培养2~3天。
10. 在转染或感染后2~3夭,将转染的或惑染的细胞按1:10或1:20传代, 加选择培养液,培养3天。换新的选择培养液,再培养4~7天直至可见到细胞克隆。
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注意事项 |
1.
如果转染的目的是为了生成稳定的产病毒细胞系,有两种选择。第一种选择是从那些已经稳定整合了载体质粒的转染细胞中进行选择。这些细胞可置于药物选择之下,对产生的药物抗性细胞进行产毒筛选。第二种选择是用“交叉感染”的包装细胞系。上述第5步中收集到的短暂产生的病毒可用来感染另一个包装细胞系,如步骤7~9。其后被感染的包装细胞可置于药物选择之下。无论用哪种方法,目的都是为了分离稳定整合了病毒基因组并产生可能的最高滴度的包装细胞。 展开 |