大批量核酸检测已成常态，日均上千的标本该如何提高...
大批量核酸检测已成常态，日均上千的标本该如何提高效率？
目前，SARS-CoV-2 感染人数超2200 万，死亡人数超80 万。COVID-19 给世界人民的生命健康带来了了巨大威胁。
2019年12月，武汉市出现多例不明原因的肺炎，2020 年1 月，通过基因组测序，我国科学家确定该不明原因肺炎的病原体是一种新型冠状病毒（2019-nCoV）[1]。2020年2月12日，世界卫生组织（worldhealth organization ,WHO）宣布将新型冠状病毒（2019-nCoV）感染引起的疾病正式命名2019冠状病毒病，（ Corona Virus Disease 2019，COVID-19）。同日，国际病毒分类委员会将其命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[2]。
从新冠肺炎疫情暴发之初，世界卫生组织就把检测每一个疑似病例视为疫情防控重中之重。5月初，WHO再次强调应检尽检的重要性。如今，越来越多国家意识到核酸和抗体检测的重要性，纷纷扩大检测范围[3]。目前，国内疫情管控进入“外防输入，内防反弹”的工作阶段，为了确保复工复产复学的顺利进行，中央应对新冠肺炎疫情工作领导小组要求“加快提升检测能力，大规模开展核酸和抗体检测”。标本数量与日俱增，这对诸多医院检验科的检验流程、检验质量和生物安全提出了更高的要求[4]。如何在现有条件下，增加日检核酸标本数量，是我们检验人不断努力的方向。在此，笔者根据本实验室实践经验，本文首次提出了提高新型冠状病毒核酸检测能力与效率的具体方案，以期为新型冠状病毒肺炎的预防和控制提供助力。
01新冠病毒核酸检测方法
新型冠状病毒为β属冠状病毒[5, 6],目前比较成熟的核酸检测技术主要有：实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction， RT-PCR）、逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和基因芯片等[7]。RT-PCR 是中国卫健委首推的COVID-19确诊方法[8, 9]。
SARS-CoV-2 属RNA病毒，需要先逆转录为cDNA，再进行扩增检测，通过荧光定量RT-PCR所得到的样本中病毒RNA 的Ct值，判断患者样本中是否含有SARS-CoV-2。
该技术可从基因水平检测病毒，具有高度的敏感度和特异度，且克服了病毒分离鉴定耗时长、抗原检测窗口期的缺点。目前临床常用的2019-nCov核酸检测试剂盒见表1，检测方法均为实时荧光RT-PCR，试剂盒主要分为2 类，二重实时荧光RT-PCR 和三重实时荧光RT-PCR（均为Taq-man 探针法）[10]，根据2019-nCov 基因组序列，已有多个研究机构公布了其检测的引物和探针序列，主要的检测靶点有ORF1ab 基因、N 基因、RdRP 基因、Spike蛋白、E 基因、ORF1b-nsp14等[11]。
表1临床常用新型冠状病毒核酸检测试剂盒一览表
实时荧光RT-PCR 检测技术可以对病毒模板RNA 进行定量分析[12]，整个检测过程无需对PCR 产物进行后期处理，缩短了检测时间，提高了检测效率，而且可以降低检测过程中可能出现的污染和假阳性；还可以通过绘制融解曲线、使用特异性探针等方式降低非特异性扩增，所以相比于常规RT-PCR，其具有操作简便快捷，特异度强，灵敏度高等优点[13-15]。
RT-PCR核酸检测方法在临床应用的优势主要体现在：
（1）检测技术成熟。RT-PCR技术在国内各大医院已应用多年，大部分三甲医院都具有标准的核酸检测实验室，相应工作人员具有PCR上岗证。
（2）技术要求相对较低。病毒培养、电镜检测以及病毒全基因组测序的方法技术要求很高，检测人员需经过长期培训方能上岗。RT-PCR技术要求相对较低，工作人员经过短期培训后，即可完成相应检测工作。
（3）检测成本低，检测速度快。病毒培养应在P3以上的实验室进行，绝大部分医院都不具备相应条件。电镜检测以及病毒全基因组测序的检测设备动辄几百万，医院难以负担，且两者需要的检测时间更长，操作更复杂。RT-PCR检测仪器相对更便宜，灵敏度高、特异性强，能快速、准确完成样本检测。
02核酸检测存在的问题及挑战
根据指南规定，SARS-CoV-2 核酸检测需在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护，对SARS-CoV-2核酸检测的工作人员必须进行严格的生物安全防护培训与实验标准操作培训[16, 17]，而我国的分子实验室建设现状是，只有大部分三甲医院具有符合生物安全二级及以上标准的临床检验实验室，具备独立开展新型冠状病毒检测的能力，很多三乙医院、专科医院、二级医院缺乏相应的实验室，检测能力非常薄弱。即使在三甲医院，具有PCR上岗证的检验人员也是相对缺少的。
当前，境外疫情暴发增长态势仍在持续，我国外防输入压力较大，国内防止疫情反弹的复杂性也在增加。在“应检尽检，愿检尽检”的要求下，复工复产复学人员需要进行核酸检测，住院患者和陪护人员均需进行核酸检测，核酸标本从日均数百增长到数千。图1为我院核酸标本送检情况统计表，从图1中，我们可以看到核酸标本数量从4月份开始明显增加，5月份继续激增。核酸标本数量的增加，不仅仅是工作量的增加，标本采集、运输、接收，检测、报告、保存等各环节均受到极大挑战，实验室超负荷运转。本实验室有4名工作人员，往年同期，我院核酸标本只有一两百，两台半自动核酸提取仪，两台核酸扩增仪即可完成检测任务，但现在日均上千的标本，以往检测能力难以完成如此艰巨的任务。
图1核酸标本送检情况统计表
SARS-CoV-2 属于RNA病毒，极易降解，因此指南[9]建议采集的样本应立即存放于专用的病毒保存液中尽快送检。
能在24 h 内检测的标本可置于4 ℃冰箱保存；24 h 内无法检测的标本应置于-70 ℃冰箱保存（如无-70 ℃保存条件，则于-20 ℃冰箱暂存）。
大量的标本，也增加了对冰箱的需求。在有资质的检测人员有限，核酸标本量大的情况下，检验人员长期不能轮换休息，工作压力大，心理负担重。夏日来临，气温上升，检测人员需要穿防护服，进行标准防护，衣物厚重而不透气，一进实验室就汗流浃背。检测工作完成后，医疗废物处置也成了难题。往往一天遗留的医疗废物有10余袋，超50Kg,常规实验室只有一个高压灭菌锅，为及时处置医疗废物，灭菌锅24小时运转，工作量进一步增加。
03提高新型冠状病毒核酸检测能力和效率的措施
3.1 增加各类仪器设备
工欲善其事必先利其器，巧妇难为无米之炊，若想增加检测能力，在现有实验条件下，首先要根据各单位核酸标本数量，增加相应仪器设备，加强实验室基础建设。
疫情发生以来，科室及时添置了一台全自动核酸提取仪，一次可处理96份标本；一台半自动核酸提取仪，一次可处理32份标本；两台核酸扩增仪，可一次处理240份标本。增加仪器数量后，实验室每天可以至少处理10批标本，检测能力大大增加。另购两台高压灭菌锅，三台高压灭菌锅一起，可以迅速处理当天的医疗废物，节省工作时间，减轻人力负担。实验室迅速购买4℃、-20℃、-70℃冰箱若干，解决了标本存放问题，避免了核酸降解对检测结果的影响。
3.2 优化检测方案
现在核酸检测实验室的提取仪，以半自动提取仪为主，少部分实验室有全自动核酸提取仪。因目前核酸标本均为咽拭子或鼻拭子，试管盖均为螺口，管内有拭子，所以标本均需人工开盖，全自动核酸提取仪也不能自动加样。如何充分利用现有仪器，是我们需要积极思考的问题。
我们的方案是，扩增试剂由试剂准备间人员配制，第一批96个标本采用机器磁珠法，全自动核酸提取仪处理，第二批96个标本采用机器磁珠法，半自动核酸提取仪处理，第三批144个标本用普通一步法提取核酸、上机[18]，第一批核酸加体系、上机，第四批标本再用全自动核酸提取仪处理，第二批核酸加体系、上机，第五批标本再用半自动核酸提取仪处理，第四批核酸加体系、上机，第六批标本再用用全自动核酸提取仪处理，第五批核酸加体系、上机，第七批标本用普通一步法提取核酸、上机。
在正常情况下，一组，两位检验人员可以在提取间4小时内处理七批，共计768个标本。下午换另一组人员进行提取相关工作。第三组人员负责标本接收，体系配制，上机扩增，结果报告。利用现有条件，通过不断优化，半自动与全自动核酸提取仪互相配合，机器磁珠法和普通一步法相结合，加样与上机见缝插针，现在实验室每天可检测超过1500份标本，迅速了增加检测标本的数量。
3.3 加强信息化建设
在疫情暴发之初，因外院和本院信息系统不同，条码不能互认，很多标本无条码，只有采样申请单及信息汇总表。随着标本的增多，无条码标本给检测工作带来许多额外工作，增加出错几率，影响患者及时查询结果。在和医务科、信息科、体检中心、护理部等积极协商沟通后，所有本院门诊、体检、住院病人的核酸标本均需贴条码，外院标本在体检中心做好信息登记后，统一生成条码，方能送检。
对于标准的分子生物实验室，各房间的墙壁具有隔音效果，这常常影响了各区实验人员的沟通交流。检测人员进入核心区后，不能在实验过程中进出房间，遇到各种问题，只能手写告知外面的同事，浪费时间又难以准确快速表达。
因此，科室迅速购置三部对讲机，使得实验人员可以无障碍交流。检测人员与其他部门人员的沟通交流存在诸多困难。医生、患者迫切希望第一时间得到核酸结果信息，其他医院和单位也希望尽快了解自己的检测情况，实验室的固定电话不能满足相应诉求。医院分别给核酸检测组、采样组配备一部手机，建立各类信息沟通交流群，极大地促进了各部门的信息沟通，节省了检测小组的人力物力。手机的拍照、视频功能，在核酸检测过程中也带来诸多便利。标本条码信息出现问题，拍照后发送至采样信息沟通群，相应人员直接处理问题；仪器出现故障，手机可视频连线外部人员，及时处理问题。所可有标本检测完毕后，由医务科以短信形式通知患者结果及是否可打印报告。短信通知使得患者可以快速住院，方便了复工复产复学人员。
3.4 改善检测人员工作条件和身心健康
根据2019新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识[17]，新型冠状病毒核酸检测人员应穿工作服、戴一次性使用帽子、医用防护口罩（N95及以上）、护目镜或防护面罩、外罩一件医用防护服、戴一次性使用手套、穿一次性使用鞋套。
厚重的装备，增加了检测人员的身体负担，护目镜起雾严重影响了操作视野，长时间的工作，让检测人员身心俱疲。正压送风头罩型动力送风过滤式呼吸器（ powered air-purifying respirator，PAPR）可以在佩戴者头肩部形成一个正压环境，可以最大程度隔离外部气体和病毒，大大降低感染风险。微正压使得佩戴者几乎没有任何呼吸阻力，也能有效避免头罩内起雾问题，可以保证面屏透亮，使操作人员视野更清晰；同时，呼吸器配套的送风头罩佩戴比较舒适，都极大地方便了检测人员的操作[19-21]。实验室购买两台正压送风头罩型PAPR，使检测人员可以更轻松的工作，提高了检测能力与效率。
目前，大批量核酸检测已成常态，具有PCR上岗证的检验人员也是相对稀缺，检测人员往往不能轮休，由于持续紧张和高强度工作，核酸检测人员常处于身心疲惫状态，如果得不到较好休息，则可能出现失眠、焦虑症状；如果叠加工作受挫或工作不被理解，则可能出现自责、无力感，或愤怒、敌对情绪。面对不断增加的标本，核酸检测人员可能会因为自我要求“过高”，造成一定的思想压力，从而导致不良情绪持续存在。
为此，院领导及科主任应时刻与核酸检测人员保持紧密联系，积极沟通生活工作中的问题，为其排忧解难，鼓励和促进同事间的沟通和交流，加强与亲属、朋友的沟通交流，鼓励有心理困扰和应激症状的医务人员主动求助和自我调整。
在没有明显增加工作时间的情况下，我实验室核酸日检测量由38例提高到1610例，日均标本处理数过千，基本满足了日常需求。从图2可以看到，通过以上多种措施，在保证检测效率的前提下，本实验室核酸检测能力不断增加。
图2 核酸标本检测情况统计图
04讨论
SARS-CoV-2 大流行是当前全球共同面临的公共卫生事件[22-24]，目前，国内疫情管控进入新的阶段，早期确诊、尽早隔离、积极干预是有效阻止疫情再次暴发的关键。
核酸检测是确诊COVID-19 的“金标准”，尽快提高新型冠状病毒核酸检测能力与效率，是完成党中央“应检尽检，愿检尽检”要求的根本途径。
新型冠状病毒核酸检测工作，实际包括标本采集、运输、接收、检测、报告等过程，并涉及医疗废物处置，检验结果上报、下传等内容，纷繁复杂。各地，特别是医疗资源相对缺乏、检测能力相对薄弱、疫情防控压力较大的地区，要建立符合生物安全二级及以上标准的临床检验实验室，具备独立开展新型冠状病毒检测的能力，还需较长时间。
我们应该审视核酸检测工作的各个环节，结合实际条件，不断改进，以提供核酸检测能力和效率。结合本实验室工作的实践经验，笔者认为各医院及检测机构，在现有条件下，应加购核酸提取仪和扩增仪，提高检测能力；优化检测方案，充分利用现有检测方法和检测试剂，提高检测效率；加购高压灭菌锅，加强处理医疗废物的能力，加强实验室生物安全管理；加强信息化建设，充分利用对讲机、手机等沟通工具，及时报告核酸检测结果；购置正压送风头罩型PAPR，减轻核酸检测人员身体负担；密切关注核酸检测人员心理健康问题，让工作人员无后顾之忧。
本文首次提出了提高新型冠状病毒核酸检测能力与效率的具体方案，可供各单位参考借鉴，相信随着技术的进步，我们将会摸索出更加高效的新冠病毒实验室诊断方案,更好更快地检测核酸标本，最大限度完成检测任务，巩固来之不易的防控成果。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突
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