PCR技术反应五要素是什么？
1、引物
PCR 反应成功扩增的一个关键条件是正确设计寡核苷酸引物。引物设计一般遵循以下原则:①引物长度:一般为15～30bp,常用为 20bp 左右,引物太短,就可能同非靶序列杂交,得到不需要的扩增产物。②引物扩增跨度:以200～500bp 为宜,特定条件下可扩增至10kb。③引物碱基:G+C 含量以40%～60%为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。A、T、G、C 最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列。④避免引物内部出现二级结构:避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物量:每条引物的浓度为0.1～0.5μmol/L,以最低引物量产生所需要的结果为好;引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。⑥引物的特异性:引物应与同一基因组中其他核酸序列无明显的同源性,即只与目标 DNA 区段有较高的同源性。
引物的作用有两个:①按照碱基互补的原则,与模板 DNA 上的特定部位杂交,决定扩增目的序列的特异性;②两条引物结合位点之间的距离决定最后扩增产物的长度。
2、模板
PCR 反应是以 DNA 为模板(template)进行扩增,DNA 可以是单链分子,也可以是双链分子;可以是线状分子,也可以是环状分子,通常来说,线状分子比环状分子的扩增效果稍高。模板的数量和纯度是影响 PCR 的主要因素。在反应体系中,模板数量一般为102～105拷贝,1ng 的大肠杆菌 DNA 就相当于这一拷贝数。PCR 甚至可以从一个细胞、一根头发、一个孢子或一个精子中提取的 DNA 为分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。尽管模板 DNA 的长短不是 PCR 扩增的关键因素,但当用高分子量的 DNA(>10kb)作模板时,可用限制性内切酶先进行消化(此酶不应切割其中的靶序列),扩增效果会更好。例如,用腺病毒载体(大小约为30kb)为模板时,先用特异的限制性内切酶(Pac Ⅰ)消化处理后,PCR 扩增效果会明显提高。
单、双链 DNA 和 RNA 都可作为 PCR 的模板,如果起始模板为 RNA,需先通过逆转录得到第一条cDNA 链后才能进行 PCR 扩增。
3、DNA 聚合酶
DNA 聚合酶(DNA polymerase)是推动 PCR 反应进行的机器,如果没有它的存在,PCR 反应就不可能进行。耐热 DNA 聚合酶包括 Taq DNA 聚合酶、Tth DNA 聚合酶、Vent DNA 聚合酶、Sac DNA 聚合酶以及修饰 Taq DNA 聚合酶等,以 Taq DNA 聚合酶的应用最广泛。Taq DNA 聚合酶是1988年由Saiki 从水栖嗜热菌(Thermus aquaticus)中分离提纯的耐热 DNA 聚合酶,分子量为94000,由832个氨基酸残基组成,热稳定性好,在75～80℃条件下每个酶分子每秒钟可聚合约150个核苷酸,是目前 PCR 中最为常用的聚合酶。一般 Taq DNA 聚合酶的活性半衰期为:92.5℃ 130min,95℃ 40min,97℃ 5min。酶的活性单位定义为74℃下30min 掺入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量。目前人们又发现许多新的耐热 DNA 聚合酶,这些酶的活性在高温下可维持更长时间。
4、dNTP
脱氧核苷酸是 DNA 的基本组成元件,为 DNA 合成所必需。PCR 中使用脱氧核苷酸通常是4种脱氧核苷酸的等摩尔混合物,即 dATP(腺嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸)、dGTP(鸟嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸)、dCTP(胞嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸)和 dTTP(胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸),通常统称为 dNTP。
PCR 扩增效率和 dNTP 的质量与浓度有密切关系,dNTP 干粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度,以1mol/L NaOH 或1mol/L Tris-HCl 的缓冲液为宜,pH 调节到7.0～7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中,dNTP 的浓度应为50～200μmol/L,尤其注意4种 dNTP 的浓度要相等(等物质的量配制),如其中任何一种浓度不同于其他几种时(偏高或偏低),就会增加错配概率。dNTP 浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+ 结合,使游离的 Mg2+浓度降低。
5、 Mg2+
反应体系中游离 Mg2+的浓度对 PCR 反应中耐热 DNA 聚合酶的活性、PCR 扩增的特异性和 PCR 产物量有显著的影响。反应体系中 Mg2+浓度低时,会降低 Taq DNA 聚合酶的催化活性,得不到足够的 PCR 反应产物;过高时,非特异性扩增增强。此外, Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与 PCR 产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。在标准的 PCR 反应中, Mg2+的适宜浓度为1.5～2.0mmol/L。值得注意的是,由于 PCR 反应体系中的 DNA 模板、引物和 dNTP 磷酸基团均可与 Mg2+结合从而降低游离 Mg2+的实际浓度,因此, Mg2+的总量应比 dNTP 的浓度高0.2～2.5mmol/L。如果可能的话,制备 DNA 模板时尽量不要引入大剂量的螯合剂(即 EDTA)或负离子(如
),因为它们会影响 Mg2+的浓度。
