免疫共沉淀
实验概要
本实验以植物叶片为试材介绍了免疫共沉淀的基本方法。
主要试剂
50uM雌激素,液氮,提取缓冲液TBS(50mM Tris-Cl,0.15M NaCl,pH 7.4,1mM PMSF,5mM Benzamidine),glycine-HCl,TBS,洗脱缓冲液(TBS,0.5mg/mL 3xflag,0.1-1% triton X-100)
主要设备
研钵,高速离心机
实验材料
5-6周大的野生型或者HopAll -FLAG转基因植物
实验步骤
1. 5-6周大的野生型或者HopAll -FLAG转基因植物在50uM的雌激素诱导12小时。
2. 取植物叶片液氮速冻后研磨,加入提取缓冲液TBS(50mM Tris-C1,0.15M NaCl,pH 7.4,1mM PMSF,5mM Benzamidine)研磨直至均匀。
3. 14000rpm于4℃离心10分钟,取上清。
4. 100000g于4℃超离心60分钟,取上清。
5. 取anti-flag M2(SIGMA ) agarose用glycine-HCl (pH 3. 5)洗1次,TBS洗3次。
6. 将anti-flag M2 agarose加入蛋白溶液,于4℃孵育4小时。
7. 500g于4℃离心5分钟收集agarose。
8. 加入1mL TBS,于4℃ 8000g离心40秒,如此反复洗5-10次,弃上清。
9. 加入50-100ul洗脱缓冲液(TBS,0.5mg/mL 3xflag,0.1-1% triton X-100)于4℃洗脱。
l0. 取样蛋白电泳,用Western检测蛋白的存在。