常用生化实验技术：分光光度法-2
3．朗伯—比尔定律如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必须将朗伯定律和比尔定律合并起来，得
＝KLC
A＝KLC
即吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯—比尔定律。
在上式中，若L用厘米表示，C用克／升表示，则比例常数K称为吸光系数，其值取决于入射的波长，溶液的性质和温度等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。
若L用厘米表示，C用摩尔／升表示，则上式中的比例常数用ε表示，得到
A=εLC
式中ε称为物质的摩尔吸光率(molar absorptivity)或摩尔吸光系数(molar absorption，coefficient)，其值相当于L=1cm时，C=1mol/L时，在一定波长下的吸光度，它是物质的特性常数。
A=εLC=ε×1×1=ε
不同的物质可能会有相同的最大吸收波长，但其摩尔吸光系数不一定相同。ε值愈大，说明该物质溶液对光吸收愈强烈，则比色测定的灵敏度愈高。
第二节分光光度计结构简介
第三节分光光度技术的应用
一、测定溶液中物质的含量
可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。这需要测定标准溶液(浓度已知的溶液)和未知液(浓度持测定的溶液)的吸光度，将两者进行比较。由于所用吸收池的厚度是一样的，可用下式进行计算。
式中Cx代表未知液的浓度，Cs代表标准液的浓度，Ax和As分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式计算得之。
也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：①灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；②可以避免其他物质的干扰。
还可利用摩尔吸光率(ε)求得测定物质的浓度，由于物质的ε是已知的，读取光径(液层厚度)为l cm时溶液的吸光度(A)，则可以用下式计算溶液中物质的浓度(C)：
此式常在紫外光吸收法时应用，无需显色反应，操作方便。
二、用紫外光谱鉴定化合物
使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度一波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。
各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线形状一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低谷的波长是一定不变的。
紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。紫外光吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。紫外光吸收光谱分析主要用于己知物质的定量分析和纯度分析。
第四节分光光度法的误差
在分光光度法中，即使将各种因素都控制好，对于浓度过大或过小的样品，误差仍然很大。因为浓度过大的样品，其吸光度过高，影响检测器的灵敏度，且读数标尺刻度的精度差，误差亦大，故难于准确。浓度过低的样品，其吸光度小，则因与仪器本身因素有关，也容易引起检测器标尺上的读数误差。例如光源波动的影响：当光源强度改变1％、吸光度为1.0时，只有0.4％的误差，但在吸光度为0.045时，则可产生9.6％的误差。实际上，在整个透光度(或吸光度)范围的不同部分均有不同的误差。从理论上推算，相对误差的最小的部分在透光度为36．8％处(或吸光度为0.4343处)，故通常认为测定值在吸光度0.20~0.80范围内(透光度为20％~65％)误差较小，超出此范围，相对误差均会增大。
影响分光光度法精确度的主要原因还有光谱纯度。分光光度计应能正确选出光源光谱中所需部分波长作为入射光，一般应保持光谱带宽度在l0
nm以下，如果测定样品有很狭窄的吸收峰，就必须有更小的光谱宽度，所以分光光度计大多均有可调的狭缝。在实际使用中，用较大狭缝虽可提高重现性，但由于加大光谱宽度反而降低了准确度。
散射光也是引起误差的重要因素；这里所说的散射光是指一切未经过测定溶液吸收，而又落到检测器上引起干扰的光，如室内自然光，经过某些漏洞进入仪器而明显增大了透光度，故高灵敏度的分光光度计宜安装的光线较暗的室内。散射光也包括能透过比色皿的非测定需要的其他波长的光，实际上是光谱不纯，但因效果与散射光一样，故也称为散射光干扰。散射光干扰对高浓度测定特别有害，能使吸光度降低，标准曲线的高浓度部分向下弯曲。
