从总细胞抽提物中确定与染色质结合的蛋白质实验
免疫共沉淀的方法
| 实验方法原理 | 完整的细胞经甲醛处理通过蛋白质－DNA 和蛋白质－蛋白质之间的交联固定体内染色质的结构。抽得细胞总抽提物并进 超声破碎使染色质溶解并将 DNA 剪切为适当长度的片段。可溶的染色质与感兴趣蛋 白质的一抗孵育，蛋白质－抗体复合物可以通过与偶联到 Sepharose 上的 G 蛋白共孵育而 被沉淀下来，因此与感兴趣的特殊蛋白交联的 DNA 分子就同时被共沉淀下来。通过对抗体复合物胶珠的洗脱，破坏蛋白质－DNA 的交联并纯化 DNA。沉淀得到的 DNA 可用 于使用特定的引物进行 PCR 扩增来鉴定富集的 DNA 序列。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 甲醛甘氨酸（加热灭菌）TBS 溶液裂解缓冲液LiCl 去垢剂洗涤剂TE 缓冲液洗脱缓冲液蛋白酶 K 溶液LiCl酚 氯仿 异戊醇乙醇 |
| 仪器、耗材 | 旋盖管平底微量离心管多孔祸旋混合器26－G 针头圆底管（17 mm×100 mm）微量离心管超声仪（探头式）旋转混合器水浴和加热器培养箱或烤箱 |
| 实验步骤 | 1. 每个实验样品需要培养 50 ml 酵母细胞生长至 OD600为 1.0～1.5。事先备好一个 50 ml 旋盖管加入室温的 37％ 甲醛溶液 1.4 ml。 2. 在管中加入酵母培养液至 50 ml 刻度以下，为即将加入的 2.5 ml 甘氨酸留出充足的空间。旋紧管盖，室温 15 min，偶尔颠倒一下管子以使溶液混合。 3. 在管中加入 2.5 ml 2.5 mol/L 甘氨酸（终浓度至 125 mmol/L） 停止交联；混合并室温 5 min。 4. 4℃， 1500 g 离心细胞 5 min， 弃上清。将细胞置冰上，用 20 ml 冰冷的 TBS 重悬。重复此步。 5. 4℃， 1500 g 离心细胞 5 min， 弃上清。用 1 ml 冰冷的 TBS 重悬细胞并转到冰冷的 2 ml 平底微量离心管中，置冰上。 6. 以最高转速短暂离心收集细胞，弃上清。 7. 如果细胞冻结了，则在冰上解冻。在细胞沉淀中加入 250 ul 冰冷的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。再加入 1 体积的玻璃珠（约 350 ul）。 8. 在多孔涡旋混合器中 4℃ 以最高速涡旋混合 30 min 以裂解细胞。 9. 加入 250 ul 冰冷的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，短暂涡旋混合。置冰上。 10. 用吸水纸快速将 2 ml 微量离心管外侧的冰和水擦掉。颠倒管子，用烧热的针头 （26-G） 在管底穿两个洞。立即将管子放入在冰上的 14 ml 圆底管中，使微量离心管正好悬挂在较大的管子的管口处。 11. 4℃， 使用翻斗式转子 1000 g 离心 3 min，将样品置冰上。确定除玻璃珠外所有的样品全都进入 14 ml 管中后，弃去盛有玻璃珠的 2 ml 微量离心管。 12. 用 1 ml 的微量加样器吸取溶液层吹吸几次重悬沉淀。然后将悬浮液转移到冰上的 1.5 ml 微量离心管中。 13. 超声破碎切割染色质使其平均大小为 500 bp：使用超声破碎仪时，12 s 启动 3 次 （如 Branson Sonifier250，能量设置 2.0，100％ 作用循环）。在每次启动之间将样品在冰上放置至少 2 min。 14. 4℃ 以最高转速离心 5 min， 沉淀为未破碎的细胞和细胞碎片。将上清转移到一个新的在冰上的 1.5 ml 微量离心管中。 15. 4℃ 以最高转速离心 15 min，将上清转移到一个新的在冰上的 1.5 ml 微量离心管中。 16. 在染色质抽提物中加入感兴趣的蛋白质一抗并混匀。4℃ 温育 1 h 至过夜。 17. 使用宽口移液头（如将前端剪掉的 200 ul 移液头），每个样品加入 30 ul G 蛋白－Sepharose 胶珠（在 PBS 的 50％ 悬浮液）并混匀。4℃ 旋转混合 1 h。 18. 室温，1000 g 离心 1 min， 取 1/10 体积（50 ul） 上清至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入 200 ul TE/1％SDS，混匀放置于 4℃ 直到步骤 27。 19. 弃去剩余的上清。加入 1 ml 裂解缓冲液在旋转混合器上室温孵育 5 min，洗涤胶珠。室温 1000 g 离心 1 min 沉淀胶珠。 20. 加入 1 ml 裂解缓冲液重复步骤 19。 21. 加入 1 ml 裂解缓冲液 500 重复步骤 19。 22. 加入 1 ml LiCl/去垢剂溶液重复步骤 19。 23. 加入 1 ml TE 缓冲液重复步骤 19。离心后，在不影响胶珠的情况下尽量去尽洗涤溶液。 24. 加入 100 ul 洗脱缓冲液，混匀。65℃ 水浴或加热器 10 min 以从抗体胶珠上洗脱沉淀物。 25. 以最高速短暂离心胶珠，将洗脱液（100 ul） 转移到新的 1.5 ml 微量离心管中。 26. 在胶珠的管中加入 150 ul TE/0.67％ SDS，颠倒离心管几次，以最高速短暂离心。将第二次洗脱液（150 ul） 与第一次的（沉淀物）合并。 27. 沉淀和总混合物（步骤 18） 在 65℃ 空气培养箱或烤箱中温育至少 6 h。 28. 加入 250 ul 蛋白酶 K 溶液，对于沉淀物，37℃ 温育 30 min； 对于总混合物，37℃ 温育 2 h。 29. 加入 55 ul 4 mol/L LiCl 和 500 ul 25：24：1 酚/氯仿/异戊醇，剧烈涡旋振荡 1 min （使用多孔涡旋混合器将很方便），室温以最高转速离心分层（沉淀 5 min； 总混合物 10 min）。 总混合物通常需要进行第二次酚/氯仿/异戊醇抽提。 30. 将上层水相转移到新的 1.5 ml 微量离心管中，加入 1 ml 100％ 乙醇。充分混合， 室温以最高转速离心 15 min 沉淀 DNA。弃上清。 沉淀管中离心后得到的沉淀颗粒非常小，几乎观察不到；而总混合物中有大量的白色沉淀。 31. 沉淀用 750 ul 75％ 乙醇清洗，室温以最高转速离心大于 5 min，弃上清。样品在空气中干燥约 10 min。 32. 用 100 ul TE 重悬来自于沉淀管的沉淀。储存于 －20℃。 33. 用 50 ul 含有 0.2 mg/ml RNase A （由 20 mg/ml 的储液稀释）的 TE 重悬来自于总混合物管的沉淀，37℃ 温育 30 min。再加入 950 ul TE 并储存于 －20℃。 34. 建立 50 ul PCR 反应，引物浓度为 1 pmol/ul，使用 2 ul 沉淀或 1 ul 总混合物作为模板。 35. 使用以下热循环参数进行热启动 PCR： 36. 在 PCR 产物中加入适当的上样缓冲液，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳通过溴化乙锭染色进行分析。 展 |
