植物总RNA的快速提取与纯化
一、原理
RNA包括rRNA、tRNA和mRNA等，大部分通常是以核蛋白复合物的形式存在的。通过SDS、苯酚处理使蛋白质变性并沉淀。利用LiCl溶解双链DNA的特性去除DNA，经乙醇沉淀得到总RNA。纯度高、完整性好的RNA，即可用于Northern杂交、纯化mRNA、cDNA合成和体外翻译等进一步的实验。
提取RNA过程中预防RNase对RNA的降解至关重要。由于RNA酶也是蛋白质，所以使所有蛋白质迅速彻底地变性同时防止了RNase对RNA的降解。可通过二乙基焦碳酸盐DEPC）处理所使用的器皿、水以及部分溶液，并在提取体系中加入RNase抑制剂等来抑制内源、外源的RNase活性。
二、目的
了解提取植物总RNA的原理和意义，掌握快速制备植物总RNA的基本方法。
三、材料、试剂
1、幼嫩的植物叶片。
2、液态氮2L。
3、Tris-Cl平衡酚(pH 8.0)。
4、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合物。
5、氯仿。
6、3M NaAc(pH 5.3)。
7、RNA提取缓冲液：0.2M Tris-HCl(H 9.0), 0.4M LiCl, 25mM EDTA, 1%SDS。
8、2M LiCl。
9、0.2M Tris-HCl, pH 9.0。
10、0.4M LiCl。
11、95％乙醇。
12、75％乙醇。
13、瓷研钵。
14、无RNase的重蒸水。
四、操作方法
1、称取植物材料0.1g。
2、在瓷研钵中倒上液氮，将材料剪成小块放入液氮中，待液氮稍少时充分研磨材料，中间可补充少许液氮。
3、将粉末刮入1.5ml离心管，加入0.55ml提取液剧裂振摇2－3分钟。
4、加入0.55ml苯酚－氯仿－异戊醇混合液，振摇1分。
5、13000rpm离心10分钟。
6、将水相转到一个新的离心管中，重复第4－5步2次。
7、将水相转至新的离心管中，加入0.55ml氯仿振摇混匀，以除去痕量的苯酚。
8、13000rpm离心3－5分钟。
9、将水相转移至新离心管中，加55ul 3M NaAc(H 5.3)和2倍体积的95％乙醇。-20℃下静置20分钟。
10、4℃条件下13000rpm离心15分，用移液枪吸去上清液。
11、加0.3ml2MliCl，用移液枪轻轻吹打使双链的DNA溶解，冰浴上静置10－30分钟。13000rpm离心15分钟，弃去上清液。
12、加0.3ml无RNase的重蒸水，振摇使沉淀溶解。
13、加30ul3M NaAc(pH5.3)和0.7ml 95%乙醇，混匀。－20℃冰箱内放置20分钟，13000rpm离心15分钟。
14、弃去上清液，加入0.5ml 75%乙醇，13000rpm离心5分钟。
15、小心吸去上清液，真空干燥10分钟。
16加入50nl无RNase重蒸水重悬RNA，然后置于－20℃保存。
17、用紫外分光光度计则定260nm和280nm处的光密度。对纯的RNA来说。OD260／OD280为2.0，1OD260约为40mg/mlRNA。
18、RNA琼脂糖变性胶分析
