滚动式循环放大(RCA)法
实验概要
滚动式循环放大(RCA)法是一种能够在恒温条件下，使标记有寡核苷酸探针(与组织细胞内的核苷酸无相关性)的抗体(特异性一抗或第二抗)与组织细胞内的抗原结合后，在DNA聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸进行循环扩增，产生一条扩增的DNA序列拷贝产物，此时，标记在抗体上的寡核苷酸得到有效扩增(109倍)，扩增后的产物与后续加入的标记有示踪物的寡核苷酸进行互补杂交，在抗原-抗体周围形成众多带有标记示踪物的杂交体，最后通过IHC方法再放大示踪物。该方法具有很高的敏感性和特异性。首先要合成三条寡核苷酸探针(引物)，然后将寡核苷酸与抗体结合，最后进行RCA免疫组化染色。
左上为寡核苷酸标记的特异性抗体与组织细胞内的特异性抗原结合；右上为DNA聚合酶作用下与放大抗体分子上结合的核苷酸；左下为用标记示踪剂的寡核苷酸进行互补杂交；右下为用IHC方法进一步放大检测。
实验步骤
1.寡核苷酸的合成与抗体连接寡核苷酸
1) 标记抗体用寡核苷酸
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3’
2) 循环放大寡核苷酸
5’-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3’
3) 带有标记物的互补检测用寡核甘酸
5’-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3’(X=生物素)，或用5’-FACTCTGAAGATCGCTTATF-3’(F=荧光素)；或用5’-HRPACTGTGAAGATCGCTTATHRP-3’(HRP=辣根过氧化物酶)。
2. 寡核苷酸与抗体的结合
连接用的抗体可以是特异性一抗，也可以是第二抗体或其他的连接二抗，如抗地高辛(Dig)、抗荧光素(FITC)或抗生物素(biotin)二抗。
1) 抗体的脱盐和活化
首先对抗体免疫球蛋白进行脱盐，然后进行抗体活化。在41 nmol抗体分子中加入410mmol的GMBS[硫代-N-(4-马来酰亚胺丁酰)硫代丁二酰亚胺，sulfo-N-(4-maleim-idobutyryloxy)sulfosuccinimide]，暗处，37℃，在氮气中30 min，移人室温中继续反应30min，用PD-10色谱柱(用pH7.5 PBS平衡柱子)除去多余的磺化-GMBS，将活化抗体4℃浓缩。此时每一个抗体分子中含有多个马来酰亚胺，可以用Ellman’s试剂滴定活化抗体的量，主要测定抗体分子上的巯基。抗体活化后与寡核苷酸连接。
2) 活化抗体与寡核苷酸结合
将28.1nmol磺化GMBS活化抗体和142 nmol硫醇寡核苷酸混合，总体积为825ul，室温中反应2h，随后移人4℃中反应过夜。
3) 纯化结合物
纯化结合物一般先用阴离子交换色谱柱Q-sepharose(先用梯度盐洗柱，然后加样，洗脱，收集结合物)，再用SephadexG-200色谱柱除去游离的寡核苷酸。纯化后结合物中寡核苷酸和抗体之比为10:1，多数情况下，1个抗体分子可结合3～5个寡核苷酸。
3. RCA免疫组化染色
1) 石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复后，PBS洗3×3min。
2) 滴加特异性一抗，37℃孵育1h，PBS洗3×3min。
3) 滴加适当稀释的寡核苷酸标记二抗IgG 200nmol/L(用100mmol/L谷氨酸钾-PBS稀释)，37℃孵育30min，PBS洗3×3cm，用100mmol/L谷氨酸钾洗。
4) 循环寡核苷酸(170mmol/L)，用φ29缓冲液稀释[缓冲液内含250mmol/L(pH7.5)Tris-HCl，50mmol/L MgCl2，lmg/ml BSA，lmmol/L dATP，lmmol/L dCTP，lmmol/LdGTP，0．75 mmol/LdTTP，0．25mol/LFITC-12-dUTP]，40ul/每片，37℃孵育30min，不洗，每张切片加入1ulφ29 DNA聚合酶(0.4U/ul)，37℃继续反应30min，PBS洗3×3mino．
5) 免抗FITC-AKP结合物1:1000稀释，37℃30min；PBS洗3× 3min；0.02mol/LTris-HCl(pH9.0内含氯化镁、左旋咪唑)洗20min。
6) NBT/BCIP显色30～240min，核固红衬染。
7) 常规树胶封片，结果观察。
