巨 噬 细 胞 吞 噬 功 能 和 杀 伤 功 能 的 检 测
| 实验步骤 | 基本方案1 巨噬细胞吞噬功能的检测材 料单核/巨噬细胞：如巨噬细胞株、小鼠腹腔巨噬细胞[单元6.1，需 用 1 0 % 平衡盐溶液（balanced salt solution， BSS) 细菌（如单核细胞增多性利斯特氏菌Li说 腦 E G D ) ，过夜培养，活 正常血清，新鲜分离或新鲜融解，置冰上备用 含 5 % (v/v) FCS的 PBS，冰上预冷 含 30% (m A O 蔗糖的PBS (滤过除菌， 4°C可保存数月） Diff-Quik 染 液（ Baxter Healthcare) 10 mmX75 mm聚丙烯塑料试管或聚苯乙烯塑料试管，带盖型 载玻片及盖玻片 振 荡 器（Labindustries) Cytospin 2 型细胞甩片机（Shandon/Lipshaw) 1 . 加入1〇ml PBS,4℃， 250g离心2min，洗涤单核/巨噬细胞，重复洗涤一次，弃上清 。用 B S S 重悬细胞，调整浓度至2.5X 107个细胞/m l ，在 10m m X 75m m 带盖塑料试管中加入0. I m l 细胞悬液。 2 . 将利斯特氏菌悬液置涡旋振荡器上混匀（约 2 X IO9 个细菌/ml) ，用 B S S 稀 释 1 0 倍 。检测巨噬细胞的吞噬功能时，细菌 经 B S S 稀释前应彻底吸净残存的细菌培养基。 3 . 充分振荡混匀细菌（使成为单细菌悬液），将 0.1m l 细菌悬液加入上述带盖型试管中(每管2. 5X I O7个细菌及2. 5 X I O 6 个细胞）。 4 . 加 入 50M1冰预冷的正常血清，再 加 入 B S S 至终体 积 lml，盖紧试管盖。将试管置于振荡器上， 37°C ， 8r/m i n 往复 振 荡 20〜30 min (不 超 过 30 min)。 5a. 基本方法： 4°C ， 250 g 离 心 8 min，弃上清。加 入 2 倍体积冰预冷的B S S ，用吸管轻轻混勻细胞。重复洗涤细胞2 次 ，彻底除去胞外未被巨噬细胞吞噬的细菌。用冰预冷 的 5 % F C S /P B S 重 悬 细 胞 ，调 整 至 合 适 浓 度（一 般 加 入 2m l 后 ，细胞浓度为 5b. 更严格的方法：同步骤5a 洗涤细胞，但 最 后 用 I m l 冰预冷 的 B S S 重悬细胞。然后用 I m l 枪 头 将 I m l 含 3 0 % 蔗 糖 的 P B S 加入试管底， 4°C ， 250 g 离 心 8 min。小心吸去 B S S 和蔗糖后，加入冰预冷的5 % F C S /P B S 重悬细胞沉淀，调 整 至 合 适 浓 度（一般 加 入 2m l 后 ，细胞浓度为IO6个细胞/m l 左右）。 6.将 0.1m l 细 胞 悬 液（约 IXlO5个细胞）加入甩片机中，室温， 650r/min离 心 5 min，将细胞固定至载玻片上。对于体积较大的巨噬细胞，细胞数量可酌情减少。 7 . 按照说明书进行Diff-Quik染色。油 镜 下（放 大 1000X ) 检 测 200个以上巨噬细胞，计录每个巨噬细胞吞噬的细菌数量，然后计算吞噬指数： 辅 助 方 案 利 用 F I T C 区分胞外黏附和胞内吞噬的细菌附 加 材 料
基本方案2 巨噬细胞杀伤功能的检测材 料细菌(如单核细胞增多性利斯特氏菌、大肠杆菌或葡萄球菌），对数生长期。冻存的细菌接种于液体培养基后，培养过夜 平衡盐溶液（BSS) 单核/巨噬细胞：如巨嗟细胞株、小鼠腹腔巨噬细胞[单元 6.1，改 用 1 0 % 豚蛋白胨或4 % (m A O 硫基乙酸盐培养基]，或 人 P B M C (单元8.1) 正常血清，新鲜分离或新鲜融解，置冰上备用 含 5 % (m A O 正常血清的BSS，冰上预冷 无菌水 2 m l锥底聚丙烯塑料试管，带 螺 口 盖（Sarstedt)，或 IOmmX 75 mm带盖锥底聚丙烯塑料试管 振 荡 器（Labindustries) 细菌培 养 板 ：如 T S A (tryptic soy agar) 培 养 板（Remel; 4°C 储 存 ，用前预热至 37℃ 13 mmX IOOmm硼桂酸玻璃试管，带 螺 口 盖（Fisher或 Coring)， 无菌 1 . 将过夜培养的利斯特氏菌振荡混匀，用 B S S 稀 释 300倍 。在 I O m m X 75m m 带盖塑料试 管 或 2m l 螺口盖塑料试管中分别加入下列成分： 0.3m l 稀 释 后细菌悬液（2. 5X 106个细菌） 50ml正常血清，冰上预冷 补 充 B S S 至终体积Iml 如 怀 疑 巨 噬 细 胞（如人肺泡巨噬细胞）可能已吞噬其他细菌，应另外设置一组不加利斯特氏菌的对照组。 2 . 旋紧试管盖。将试管置振荡器上， 37°C ， 8r/m i n 往 复 振 荡 15〜20 min，使巨噬细胞充分吞噬细菌。充分洗涤去除未被吞噬的胞外细菌（见 基 本 方 案 1，步 骤 5a 或 5b)，将细胞重悬于I m l 含 5 % 血清的B S S 中。 3 . 取 4 只螺口玻璃试管，每 管 加 入 0.9m l 无 菌 水 。在 第 一 管 中 加 入 0.1m l 细胞悬液(水只裂解巨噬细胞），在余下的3 只试管中依次进行1 0 倍系列稀释。不同试管间稀释时需更换枪头，并将细胞混匀。 4 . 将各试管中液体充分混勻，各 取 0.1m l 液体分别涂布在预热至37°C 的 T S A 细菌培养板上。 5 . 将剩佘的未稀释细胞悬液盖紧。 37°C 孵 育 90〜120 min，使巨噬细胞充分杀伤细菌。然后将试管置冰上，抑制细菌生长。将 细 胞 悬 液 进 行 1 0 倍系列稀释并涂板，方法同上。 6 . 待涂布的液体被琼脂吸收后，将细菌培养板倒置于37°C 孵 箱 ，培 养 24〜28 h 。计数细菌克隆数，比较样品孵育前后细菌克隆数的变化（如 37°C 孵育后细菌克隆数减少，说明细菌被巨噬细胞杀伤）。 细 菌 培 养 使 用 标 准 37°C 孵 箱 而 非 CO2饱 和 湿 度 细 胞 培 养 箱 ，对 细 菌 培 养 来 说 ，后 者 湿 度 过 高 。 辅助方案单核细胞增多性利斯特氏菌的制备材 料致病性单核细胞增多性利斯特氏菌（A T C C :15313株），或其他细菌，如从患者分离培养的细菌 胰 蛋 白 胨 肉 汤（Difco) 70°C 水 浴（推荐使用） 1 . 将适量细菌接种到胰蛋白胨肉汤中（接种量根据细菌保存方式而定，如冻存、保存在半固体斜面培养基上或肉汤中），在 37°C 水浴中振荡培养至对数生长期（4〜6 h)。 2 . 将每份0.5m l 菌液加到I O m m X 75m m 带盖聚丙烯塑料试管中，一80°C 保 存 备 用（可保存> 1 年） 4 . 对数生长早期细菌：取 Im l 菌液加到新鲜肉汤中，继续培养 4〜6 h。 5 . 热灭活细菌：将对数生长期细菌置 70°C 水 浴 ，灭 活 60 min。 4°C ， 900 g 离 心 20 min，弃上清。加 入 IOml P B S 洗涤细菌。最 后 用 P B S 重悬细菌，调 整 浓 度 至 1010个细菌/ |
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