PrimeScript RT Reagent Kit反转录PCR实验
实验概要
PrimeScript RT Reagent Kit反转录实验
主要试剂
PrimeScript RT Reagent Kit（Takara）
主要设备
PCR仪（Roche）
实验步骤
实验前准备
提前打开制冰机
反转录反应【SYBR® Green分析法】
按表1组份配制 RT 反应液（反应液配制请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性,减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入 RNA样品。
表1
试剂
使用量
终浓度
5×PrimeScript Buffer（for Real Time）
4 μl
1×
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1 μl
Oligo dT Primer（50 μM）
1 μl
25 pmol
Random 6 mers（100 μM）
1 μl
50 pmol
Total RNA/对照样本
X ul
RNase Free dH2O
up to 20 μl
反转录反应条件如表2
表1
步骤
条件
时间
循环数
1
37℃
15min（反转录反应）
1
2
85℃
5s（酶失活反应）
1
3
4℃
保持
1
cDNA PCR反应
cDNA PCR之前，上述各样本中加入RNase H，去除RNA模板，取适量cDNA进行普通PCR，所用引物见表3，其中β Tubulin内参引物参考文献，PCR条件如下见表4。
表3
引物名称
序列（5’> 3’）
长度
FR cDNA F
AGGACAGACATGGCTCAGCGGA
396bp
FR cDNA R
TACCCGCTCTTTGCGCCAGC
β Tubulin cDNA F
AATCCCCACCTTTTCTTACTCC
121bp
β Tubulin cDNA R
AAAGATGGAGGAGGTTCCC
表4
步骤
温度
时间
循环数
1
95
2min
1
2
94
45s
35
3
56/Tm-3
30s
4
72
45s
5
72
10min
1
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