| 实验方法原理 |
三种不同的核酸酶——S1 核酸酶、RNA 酶、外切核酸酶Ⅶ被用来进行 RNA 定量，确定内含子位置，以及用来鉴定在克隆的 DNA
模板上的 mRNA 的 5' 端和 3' 端的位置。当检测 RNA 被杂交到 DNA 模板上时，用核酸酶 S1 进行保护试验的分析；当检测
RNA 被杂交到来自 DNA 模板的 RNA 上时用 RNA 酶。 |
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| 实验材料 |
T4 噬菌体多聚核苷酸激酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段 S1 核酸酶 S1 核酸酶消化缓冲液 限制性核酸内切酶 载体 RNA 标准 RNA 单链 RNA DNA 探针 |
| 试剂、试剂盒 |
过硫酸铵 复性缓冲液 乙醇 凝胶洗脱缓冲液 RNA 杂交缓冲液 S1 核酸酶终止缓冲液 苯酚 氯仿 RNA 加样缓冲液 乙酸钠 TE 四甲基乙二胺 三氯乙酸 |
| 仪器、耗材 |
变性聚丙烯酰胺凝胶 水浴 Whatman 3 MM 滤纸 |
| 实验步骤 |
一、材料
1. 缓冲液和溶液
过硫酸铵（10%)
10X 复性缓冲液（100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，100 mmol/L MgCl2，0.5 mol/L NaCl，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT））
乙醇
凝胶洗脱缓冲液（0.5 mol/L 乙酸铵，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.1% （m/V) SDS）
RNA 杂交缓冲液
S1 核酸酶终止缓冲液（4 mol/L 乙酸铵，50 mmol/L EDTA（pH 8.0），50 ug/ml 载体 RNA）
苯酚：氯仿（1:1，V/V）
RNA 加样缓冲液
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6)
四甲基乙二胺（TEMED)
三氯乙酸（TCA）(1% 和 10%)
2. 酶和缓冲液
T4 噬菌体多聚核苷酸激酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶的 Klenow 片段（10 单位/μl)
S1 核酸酶（与 S1 核酸酶消化缓冲液一起使用）
S1 核酸酶消化缓冲液（0.28 mol/L NaCl，0.05 mol/L 乙酸钠（pH 4.5)，4.5 mmol/L ZnSO4·7H2O）
限制性核酸内切酶
3. 凝胶
含 8 mol/L 尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
载体 RNA ( 酵母 tRNA)
含有四种 dNTP 的溶液（20 mmol/L)（用 25 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0) 溶解 dNTP，分装成小份储于 -20℃。）
标准 RNA
溶于蒸馏水中的合成寡核苷酸（10 pmol/μl )
模板 DNA ( 1 μg/μl），单链
单链 RNA
5. 探针
均匀标记且是单链的 DNA 探针
6. 放射性化合物
[γ-32P] ATP（10 mCi/ml，3000 Ci/mmol）
7. 专用装备
水浴，分别预设为 65℃，85℃，95℃，以得到适合的消化温度以及理想的杂交温度。
Whatman 3 MM 滤纸（或相当材料）
二、方法
随机标记的单链 DNA 探针的制备
1. 制备含 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺微型凝胶（13 cm X 15 cm X 0.75 cm ) ( 例如 Bio-Rad Mini-Protean)
(1) 混匀下列试剂
7.2 g 尿素
1.5 ml 10X TBE
加入适当量的 40% 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺 19:1）制备含有所需浓度的聚丙烯酰胺凝胶。
(2) 加水到终体积 15 ml
(3) 室温下在磁力搅拌器上搅拌直至尿素溶解。再加入：
120 μl 10% 过硫酸铵
16 μl TEMED
快速混匀溶液并将胶倒入微型胶的模子。
2. 在胶凝结的过程中，混合下列试剂：
10 pmol ( 1 μl）未标记的寡核苷酸
10 μl [γ-32P] ATP（10 mCi/ml，3000 Ci/mmol）
2 μl 10X 多核苷酸激酶缓冲液
6 μl H2O
10 单位（1 μl）多核苷酸激酶
将反应混合物 37℃ 温育 45 min，再 95℃ 温育 3 min 灭活多核苷酸激酶。
3. 向激酶反应中加入：
2 μl（2 μg）单链 DNA 模板
4 μl 10X 复性缓冲液
14 μl H2O
将反应混合物 65℃ 温育 10 min，再冷却到室温。
4. 向第 3 步的反应混合物加入：
4 μl dNTP 混合物
1 μl (10 单位）大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段
将反应混合物室温温育 15 min，再 65℃ 温育 3 min 灭活 DNA 聚合酶。
5. 调整反应混合物的离子组成和 pH 值以适应限制性酶。加入 20 单位限制性酶，于适当温度消化 2 h。
6. 向限制性核酸内切酶消化反应中加入：
2 μl 载体 RNA
5 μl 3 mol/L 醋酸钠（pH 5.2)
用标准的乙醇沉淀法回收 DNA 探针。
7. 用 20 μl 凝胶上样缓冲液溶解 DNA，95℃ 温育 5 min 使之变性，然后快速冷却到 0℃。
用凝胶电泳纯化探针
8. 当 DNA 在 95℃ 温育时，清洗凝胶的加样孔除去尿素，立刻加入探针。
9. 电泳直至溴酚蓝到达凝胶的底部（200 mA 约 30 min)。
10. 除去灌胶装置，让胶贴附在底层玻璃板上。用塑料膜（例如 Saran 膜）包裹凝胶和玻璃板。确保胶和塑料膜间没有气泡。
注意：撬开玻璃片时，戴上保护眼睛的装置。
11. 让凝胶在 X 线片上曝光。在胶片上作出玻板角和边的永久的记号。同时作出溴酚蓝和二甲苯腈蓝位置的记号。
通常 2~10 min 的曝光足够得到放射标记探针的图像。
12. 分开玻璃板和胶片，用手术刀除去放射标记的条带。将切过的胶在一张新的胶片上曝光，以保证含有正确分子大小条带的凝胶区域确实被切下来。
13. 将切下的凝胶片段转入灭菌的微离心管中，加入恰好足够体积的凝胶洗脱缓冲液盖住凝胶（250~500 μl)。将盖上的离心管在摇床上室温过夜。
14. 最大转速离心 5 min。
15. 用自动的吸量装置将上清转入新的离心管中，注意不要吸入聚丙烯酰胺。标记的探针用液闪分光镜检测应为大约 10000 cpm/μl。
16. -70℃ 保存探针。
待测 RNA 和放射标记的 DNA 探针间的杂交
17. 将 0.5~150 μg 的 RNA ( 待测的和标准的）平均分入每一个灭菌的微型离心管中。向每一个管中加入过量的均匀标记的单链 DNA 探针。
18.
加入 10% 体积的 3 mol/L 醋酸钠（pH 5.2)，2.5 倍体积的冰冷的乙醇，沉淀 RNA 和 DNA。0℃ 放置 30
min，最大转速 4℃ 离心 15 min 回收核酸。去除乙醇的上清，用 70% 的乙醇洗涤，再次离心。小心的除去所有的乙醇，将含有 RNA 和
DNA 的沉淀室温放置直至乙醇的残迹蒸发。
19. 用 30 μl 杂交缓冲液溶解核酸沉淀。吹吸几次以保证沉淀彻底溶解。
20. 将离心管的盖盖紧，将杂交反应在 85℃ 水浴温育 10 min 使核酸变性。
21. 快速将离心管转移到调至杂交温度（通常 65℃）的水浴中。转移过程中，不要让离心管冷却到低于杂交的温度。在选定的温度下，将 DNA 和 RNA 杂交 12~16 h。
S1 核酸酶消化 DNA-RNA 杂合体
22. 注意保持离心管浸没在水中，打开管盖。快速加入 300 μl 冰冷的 S1 核酸酶消化缓冲液，并立即将离心管从水浴中拿出。温和振荡以混匀离心管中物质，再将离心管转移到调至 S1 核酸酶消化温度的水浴中。根据所需要的消化程度，温育 1~2 h。
23. 将反应体系冷至 0℃。加入 80 μl S1 核酸酶终止缓冲液并振荡混匀溶液。
24. 用苯酚：氯仿萃取反应体系一次。反应体系在微型离心管中以最大转速室温离心 2 min，将上淸转到另一个离心管中。加入两倍体积的乙醇，混匀，-20℃ 放置 1 h。
25. 以最大转速 4℃ 离心 15 min 回收核酸。小心的除去所有的上清，将打开的离心管在室温放置直到可见的乙醇残迹蒸发掉。
用凝胶电泳分析 S1 核酸酶产物
26. 用 4 μl TE 缓冲液（pH 7.6) 溶解核酸沉淀。加入 6 μl 上样缓冲液并混匀。
27. 95℃ 温育核酸 5 min，立即转移到冰上。稍微离心使样品聚集在离心管的底部。
28. 用聚丙烯酰胺 8 mol/L 尿素的凝胶电泳检验放射标记的 DNA。
29. 当示踪染料在胶上移动了适当的距离后，关掉电源拆卸电泳装置。轻轻的橇开大玻璃板的一角并将大玻璃板从胶上移开。为确定方向，切下胶的一角。
30. 将含有胶的玻璃板转移到含过量的 10% 三氯乙酸的托盘中。室温下轻微晃动托盘 10 min。
31. 将 10% 的三氯乙酸溶液倒掉，换过量的 1% 三氯乙酸。室温摇动 5 min。
32. 倒掉 1% 的三氯乙酸溶液，用去离子水轻微的漂洗一下已被固定的胶。将玻璃板和胶一起拿出托盘，放在平的地方。用纸巾除去多余的水。
33. 剪下每一边都比胶长 1 cm 的 Whatman 3 MM 滤纸（或相同材料）。将纸置于胶的上面再将玻璃板颠倒过来从而把胶转移到滤纸上。
34. 移去玻璃板，把胶放在凝胶干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。
35. 获得干胶的放射自显影图。用光密度测定法或磷光成像法扫描图像，或者切下含有片段的凝胶用液闪分光光度计计量。
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