SI 核酸酶是种内切酶，它是从米曲霉米曲霉 (Aspergillusoryzae) 中分离得到。它能降解单链核酸，却不能降解双链核酸。此外，它能高灵敏度地降解局部错配的双链分子，即使只有一对碱基错配，也能因 S1 核酸酶的切割而被检测出来。用 S1 核酸酶来识别和切割错配或未复性的区域，再通过变性内烯酰胺凝胶电泳分析切割产物。
| 实验材料 | [γ-32P」ATP合适的寡核苷酸DNA 模板l10XdNTP 混合物KLenow 片段合适的限 制性内切核酸酶X 射线胶片洗脱缓冲液tRNA石蜡油S1 核酸酶 |
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| 试剂、试剂盒 | 10X 激酶缓冲液PNK10X 复性缓冲液6% 聚丙烯酰胺 8mol L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料乙酸钠4X 杂交缓冲液去离子甲酰胺S1 缓冲液S1 终止缓冲液异丙醇 |
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| 仪器、耗材 | 垂直电泳装置水浴杂交管杂交炉 |
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| 实验步骤 | 一、材料与设备
1) 垂直电泳装置
2) 水浴
3) 杂交管
4) 杂交炉
5) 用于从单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针的试剂。①10X 激酶缓冲液:400 mmol/LTris-HCl(pH7.8),100 mmol/LMgCL2，1OOmmol/L 疏基乙醇，250 ug/ml 牛血淸白蛋白储存于 -20℃ ②[γ-32P」ATP(比活度 3000Ci/mmol)③合适的寡核苷酸：溶于蒸馏水，浓度为 l0 pmol/L, 存于 —20℃ ④ PNK（polynuclemidekinase）：多核甘酸激梅，浓度为 10 U/ul, 存于 20°C.⑤10X 复性缓冲液：100mmol/LTris-HCl (ph7.5).，l00 mmol/L MgCl2，500 mnnol/L NaCl，10O mmol/L DTT⑥DNA 模板：l mg/ml ⑦10XdNTP 混合物：5 mmol/LdATP、dCTP、dGTP、dTTP,.⑧KLenow 片段：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的大片段，浓度为 lOU/ul 存于 -20℃,⑨合适的限制性内切核酸酶。⑩6% 聚丙烯酰胺/8mol/L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料。⑪X 射线胶片：需具有合适的灵敏度.⑫洗脱缓冲液：50 mmol/L TrisHCl(PH7.5)，0.5 mmol/LEDTA。⑬3mol/L 乙酸钠 (pH7.4)⑭tRNA:10 mg/ml 储存液，储存于-20°C
6) 杂交和 S1 分析。①4X 杂交缓冲液：1.6 mmol/LNaCl，40 mmol/LPIPES(pH6.4)。②去离子甲酰胺。③石蜡油。④S1 缓冲液：300 mmol/LNaCl30 mmol/L 乙酸钠 (pH4.5);4.5 mmol/L 乙酸锌，⑤S1 核酸酶：浓度为 10U/ul，储存于-20℃。⑥S1 终止缓冲液：2.5mol/L 乙酸铵,50 mmol/LEDTA⑦异丙醇
二、操作方法
(一）单链 DNA 探针的制备
1. 由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针
1) 寡核苷酸探针的标记：在 0.5 ml 离心管屮加入下列组分:
寡桉苷酸 1ul
[γ-32P]ATP 10ul
l0x 激酶缓冲液 2ul
dH2O 6ul
多核苷酸激酶 1ul
将上述组分混合，于 37℃ 保温 45 min 以标记寡核苷酸探针，最后于 95℃ 保温 2 min 以灭活多核苷酸激酶。
2) 加入 2ul 笋链 DNA 模板，4ul10X 复性缓冲液，14ulH2O，依次在 65℃10 min，55℃ lOmin，37℃ lOmin 保温
3) 加入 4ul NTP 混合物，lul Klenow 片段，室温作用 10 min 后于 65℃15 min, 灭活Klenow 片段
4) 加入适量的 NaCl 或通过稀释校正混合物的浓度，加人 20U 限制性内切核酸酶，37℃ 保温 60 min
5) 加入 2ul tRNA 储存液 A1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠，3 倍体积的乙醇 5 置于干冰中 10 min，12000 g 离心 15 min 以沉淀样品
6) 加入 20ul 甲酰胺染料重悬沉淀，于 95℃ 加热上取样于 6% 聚丙烯酰胺/尿素凝胶 h, 至溴酚蓝达到凝胶底端时结束电泳。
7) 凝胶用 X 射线感光片曝光 5 min，确定单链 DNA 片段的位置。切下相应的条带，置于 500ul 洗脱缓冲液中过夜。
8) 加入 50ul 乙酸钠 T20ugtRNA,lml 乙醇。置于一 20℃ 中 2 h,12000 g 离心 20 min
9) 将沉淀作放射活性计数后重悬干甲酰胺中按 lO5 cmp/ul), 储茌于一 20°C。此探针剂吋用于杂交和 S1 分析
2. 从双链 DNA 模板制备单链 DNA 探针
除下列步骤外, 其余步骤均 1「由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针'
1）先用所选的限制性内切核酸酶切割双链质粒（20ug)，沉淀重悬于水中，浓度为 lmg/ml
2) 复性步骤 1「由单链 DNA 模板制备笮链 DNA 探针」屮第 2) 步需快速进行。加热灭活多核苷酸激酶后加入 2〜5ug 酶切质粒、、4ul10X 复性缓冲液、14ul 水。95°C 保温 5 min，立即置于冰水屮，然后按步骤由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针」中第 3) 步进行。
3) 省去限制性酶切，即 1「由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针」中第 4) 步。
(二）杂交和 S1 核酸酶分析
1) 于 0.5 mlEppendorf 管中加入下列组分：
探针（共 10000cpm) 10ul
4X 杂交缓冲液 5ul
RNA(总 poly(A)+RNA 或离体合成的） 5ul
石蜡油 (以防止蒸发） 20ul
混勻于 37℃ 保温 4〜16 h。
2) 加 200 ul S1 缓冲液 (含 S1 核酸酶 100U)，充分混匀，置于 37°C 中 5〜30 min。加入 50 ul S1 终止缓冲液终止反应，并加入 40 ug tRNA，300ul 异丙醇. 置于干冰屮 15 min,12000 g 离心 15 min
3) 用 80% 乙醇洗沉淀物，晾干后重悬于 3ul 甲酰胺染料中，95℃ 加热 5 min，上样于6% 聚丙烯酰胺/尿素凝胶，电泳至溴酚蓝到达凝胶底端，将凝胶曝光 8〜48 h
收起 |
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| 注意事项 | 1) 寡核苷酸长度为 20〜25 个核甘酸，并与所分析的 DNA 互补。
2) 单链或双链 DNA 模板均按标准方法制备，与双链 DNA 模板制备探针相比，用单链 DNA 模板制备探针的优点主要是探针的得率更高，用单链模板制备时比活可达 1X106-1.5×106cpm
3) 为提高片段的冋收率，限制性内切核酸酶应于寡核苷酸杂交处 3＇端 200〜600 个核酸的位置上进行酶切，更长的片段就难于从丙烯酰胺胶中回收。如果所用的限制性内切核酸酶切割 DNA 模板上的不止一个位点，只要它们位于探针序列以外，就不会有妨碍。
4) 所分析的 RMA 种类不同，杂交时间亦不同. 若用细胞质总 RNA 或 poly(A)+RNA 样品，成于 37°C 至少杂交 12 h; 而用体外转录的 RNA 则杂交 2〜4 h.
5) 分析离体转录的 RNA 时，S1 核酸酶作用时间町先选择 15 min、30 min、60 min 三种，这样可以确定将所有的单链核酸，包栝游离的探针，均被完全消化所需的条件，分析细胞质总 RNA 或 Poly(AVRNA 时，S1 核酸酶的最佳消化时间为 30 min，往往比消化离体转录的 RNA 所需的时间（15 min) 要长一些。 |
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