质粒提取（三）
10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)分钟。
11)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。
注:当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤9)之间增加一步，即用酚:氯仿进行抽提，可以避免这一问题。
(二)质粒DNA小量制备的问题与对策
裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题:
1)有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。
2)在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。
三、质粒DNA的大量制备
在丰富培养基中扩增质粒
细菌的收获和裂解
收获
碱裂解法
(一)在丰富培养基中扩增质粒
许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA，而且重复性也很好。
1)将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。
2)将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分)，所得培养物的OD600值约为0.4。
3)可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。
4)于37℃剧烈振摇(300转/分)，继续培养12-16小时。
(二)细菌的收获和裂解
1.收获
1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
2)按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。
2，碱裂解法
1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml(18ml)溶液I中。
溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。
3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。
5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)]。
6)上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。
7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
8)小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10)纯化。
