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用于样品前处理的自动化移液平台

2020.3.04

自动化高通量LC-MS/MS法分析维生素D结合蛋白

本文介绍的工作流程是利用自动化移液工作站进行样本前处理，96个样本只需不到20min的时间，与其它样本制备方法相比， TurboFlow技术能够明显改善去除样品基质组分的效果。

分析血清中总25-羟基维生素D2/D3(简称25OHD，结构如图1)是许多生物实验室的日常检验工作之一，而有越来越多的实验室选择用液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)的方法来实现这一检测。

与其它样本制备方法相比，Thermo Scientific TurboFlow技术能够明显改善去除样品基质组分的效果。但在进行LC-MS/MS分析前，仍需进行一些前处理步骤，其中最重要的是完全去除样本中内源性的维生素D结合蛋白，以及为定量实验添加内标。以处理96个样本为例，手工法将会多耗时2h以上。本文介绍的工作流程是利用自动化移液工作站进行样本前处理，96个样本只需不到20min。

另外，串联质谱方法本身对于区分一些25OHD的代谢产物会有困难，比如3-epi-25-羟基维生素D3。为了精确定量25OHD3，LC-MS/MS延长了色谱分析时间，以区分和解析3-表-25-羟基维生素D3。

实验条件

样品制备

人血清样品来自于国际维生素D质量评价体系(DEQAS，样品404和405)，所有的移液设备均使用Thermo Scientific Versette自动移液工作站。移液流程参见图2。Versette系统配合96道移液头和DARTs 300µl加长型枪头。标准品和质控品(均来自Chromsystem MassChrom 25-Hydroxyvitamin D2/3 Kit)以及样品(100µl)从1ml Thermo Scientific Nunc Cryobank冻存管中转移到96孔板。内参溶液(25µl，H6-25OHD3)和沉淀剂(200µl)，均来自于Chromsystem公司，放置于储液槽内。96孔板先在微孔板振荡器上振荡混匀(600rpm，10min)，随后离心(200g，3min)，上清液收集于新的96孔板内。将板用粘性膜封口后置于Thermo Scientific Transcend TLX-2系统上分析。所有用到的耗材列于表 1。

液相色谱

样品上清(100µl)在湍流条件下(2ml/min)注射入TurboFlow XL C18柱(50×0.5mm i.d.)。待分析物从TurboFlow柱中反向冲入Thermo Scientific Accucore PFP分析柱(2.6µm粒径，50×2.1mm i.d.)。

质谱

质谱在Thermo Scientific TSQ Vantage三重四极杆质谱仪上进行。样品以大气压化学电离的方式进样，每次MS/MS数据分析5min。整个LC时间为14min，如图7所示。

结果与讨论

如图7所示，25OHD3，3-epi-25OHD3和25OHD2的保留时间分别为10.94min，11.47min和11.82min。总的分析时间为14min，包括柱再平衡时间。样品405有效分离出了3-epi-25OHD3，而若使用C18柱作为LC-MS/MS中的分析柱来使用的话，这一成分将会被误认为是25OHD3，因为C18柱不能有效区分异构体。

结论：

Versette自动移液工作站帮助整个实验流程节约了80%的时间，对于96个样品的制备来说，从2个小时缩短到不到20min!另外，在本实验流程中，Versette的使用可以完全替代864次的人工移液，最大程度减小人工操作误差，提升了方法的精确性，并降低了实验室人员的工作强度。

同时，应用Transcend TLX-2样品前处理系统和五氟苯基固相分析柱，本方法能够成功解析3-epi-25OHD3，避免了常规LC-MS/MS方法分析时对25OHD3的干扰，并且不降低色谱的通量。

同样的自动化液体处理和自动化在线样品前处理实验流程可应用于分析其他化合物，包括质谱免疫分析流程(MSIA)测定PTH和维生素D结合蛋白。

图1.25-羟基D2/D3结构示意图。

图2. 液体处理程序图。

图3.Cryobank冻存管。

图4. 8通道手持式旋盖封口机/启盖器。

图5.Versette 自动移液工作站及DARTs吸头。

图6.Transcend在线净化系统和 TSQ Vantage 质谱仪。

表1：不同液体处理步骤所需耗材配件列表

步骤	所需耗财配件	订货号
1	1 ml Cryobank 冻存管 (每板96个)	374088
2	8通道手持式加盖/去盖器配支架	4105NUN
3	Thermo Scientific Matrix 96 深孔板储液槽	1064-15-6
4	过滤板	Chromsystems
2-8	Thermo Scientific Versette自动移液工作站 -主机 - 96和384通道移液头室 - 6 位载板架 - 96 通道移液头5-300µl	650-01-BS 650-02-NTC 650-03-SPS 650-06-96300
4-7	300μL 加长型 DARTS吸头	5536
8	微孔板振荡器	4625-1CEQ
9	Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400离心机配微孔板适配器	75008371
10	Nunc 微孔板封板垫 Nunc 96孔微孔板 (1.0 ml)	276002 260252