聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆（四）
[注意]
1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。
2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。
四、载体加dT尾
1、将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2、在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。
3、加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。
4、按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5、加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1hr。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。
2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1、 在50ml的PCR产物中，直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。
2、 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3、 用酚:氯仿抽提2次。
4、乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。
5、 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1ml （约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。
6、取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
[注意]
1、PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
2、吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
3、加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
4、应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
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焦点事件
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技术原理
