密度梯度离心基础知识（二）
（2）各种转头用于等密度离心的优缺点分析：
A、固定角式转头：主要用于差分离心的角式转头，在超速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是
DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为 10~40ml。常用转速
40,000~80,000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。
B、甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较小，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构原因此类转头最高转速一般在
60,000rpm以上）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头最高速在 40,000~41,000rpm，用作自行成
CSCL梯度的质粒 DNA离心往往需要 50~70小时。
C、垂直管转头：适合作等密度离心，沉降距离最短，在没有沉淀或沉淀非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。这类转头转速很高（目前最高转速可达
100,000rpm，700,000×g）离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。
D、近垂直转头：九十年代开始使用的新型转头，用作生物大分子（ DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心最佳，目前这类转头的最高转速已达 100,000rpm近750,000×g），离心时间比垂直转头稍长。
E、区带转头：非常适合做大容量样品的等密度离心。
F、连续流离心转头：高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心，超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。
三、密度梯度——材料和梯度型式的选用
1、对于速率-区带密度梯度离心，梯度选择要点
（1）概述：用速率-区带法（Rate-Zonal，简称R-Z法）进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离纯化样品，因此希望样品沉降能通过整个离心管长度来提高分辨率。作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须小于样品颗粒的密度。
用有密度梯度的支持液作R-Z离心有以下优点：
●当样品中不同组份分层进入梯度液时，梯度的较高密度支持着样品，这样就使混合样品中各个不同密度的层次以较窄（或较薄）的区带沉降从而得到较高的分辨率（或较高的纯度）。
●梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加，这样就可以稳定液柱，提高抗对流和抗机械扰动的能力（接近离心过程结束时，纯样品区带和它的支持液的密度差较小）。
●梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率。而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠拢，提高了分离纯度。
（2）梯度材料的选用
一个理想的梯度液应具备：化学稳定性好；高溶解度；低渗透性；在溶剂中的稳定性；较低的光吸收特性；低廉等。遗憾的是很难找到一种适合于各种 R-Z离心的完美无缺的梯度液。
对于大多数R-Z离心，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（40~60%
W/
W）时粘性系数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时（即使是低密度时也如此）有较高的渗透性，分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料，如由
Pharmacia公司开发的 Ficoll等等。
在大多数情况下，梯度液的 PH值应与被分离时生物制品的生理 PH值一致。
对密度梯度材料的基本要求：
（a）能够配制所需要的密度范围
（b）粘性系数较低
（c）溶解度高
（d）有密度与光折射率的对照资料
（e）对被分离样品无损害
（f）对被分离样品渗透很少
（g）在离心分离完成后很容易与生物样品分离
（h）化学性能稳定
（i）对离心过程中所接触的转头材料，离心管，管盖及密封件，连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用。
（j）纯度高
（k）毒性少
（l）价格较低
（m）已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。
常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钾、碘化钾、氯化铯、氯化铷、三氯醋铯、三氟醋酸铯、右旋糖苷、白蛋白、 Ficoll、Percoll、Metrizamide、 Nycodenz、Ludox、Dextran等等。
（3）梯度形状的选择
所谓梯度形状是指梯度介质沿着离心管长度方向的密度变化特征。用于
R-Z离心密度梯度常用连续梯度也就是密度随着离心半径的增加而光滑地（不是突变地）增大，直线型的，光滑曲线型的（一般用凸指数或凹指数曲线，或凸凹指数曲线联用的）都属于连续梯度。不连续（阶梯型）梯度多用于等密度离心。
●线性梯度：
在甩平转头中做 R-Z离心最常用线性梯度。
制备线性梯度时要注意：
在甩平或垂直转头中制备线性梯度时，梯度液面的密度必须足以支持样品，而底部密度必须小于被分离样品各个组份的密度。
一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率。
蔗糖的常用线性梯度范围是 5~20%W/V或 10~40%W/V。
可以用梯度仪制备线性梯度，也可以人工铺设数个阶梯型梯度，离心管静置一段时间后也可以形成近线性梯度。
