电泳技术基本原理和影响电泳速度的因素-2
设：某物质（A）在电场中移动的距离为
另物质（B）的移动距离为
则：两物质移动距离之差为：
3-3
（3-3）式指出物质A、B能否分离决定于两者的迁移率。如两者的迁移率相同，则不能分离；如有差别则能分离。实验所选择的条件如电压和电泳时间与两物质的分离距离成正比；电场的距离（如醋纤膜长度）与分离距离成反比。
三、影响电泳速度的因素
电泳速度与电泳迁移率是二个不同的概念，电泳速度是指单位时间内移动距离（cm/t），而迁移率是指单位电场强度下的电泳速度（cm2/V·t）。但二者又是密切相关的，电泳速度越大，迁移率也越大。影响电泳速度的因素有：
（一）、样品 被分离物的带电荷量多少和电泳速度的关系成正比。带电荷量多，电泳速度快，反之则慢。此外，被分离的物质若带电量相同，分子量大的电泳速度慢，分子量小的则电泳速度快，故分子大小与电泳速度成反比。球形的分子要比纤维状的快。
（二）、电场强度 电场强度是每1cm的电位降，亦即电势梯度。例如支持体为纸时，纸的两端分别浸入两个电极溶液中，电极缓冲液与纸的交界面间纸的长度为20cm，测得电位降为200V，则纸上电场强度为10V/cm。电场强度愈高，带电质点移动速度也愈快
（三）、缓冲液 缓冲液能使电泳中的支持介质保持稳定的pH，并通过它的组成成分浓度等因素影响着化合物的迁移率。
1．pH溶液的pH值是决定物质带电质点解离程度，即该物质带净电荷多少的决定因素。对蛋白质、氨基酸等两性电解质来说，缓冲液的pH值距等电点（pI）越远，质点所带净电荷越多，电泳速度也越快；反之则越慢。因此，当分离蛋白质混合液时，应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异增大，以利于分离。通常血清蛋白电泳时，采用pH8.6的缓冲液，pH值大于血清中各种蛋白质的等电点，所以蛋白质均带负电荷，故向正极移动。
2．成分通常采用的是甲酸盐、乙酸盐、柠檬盐、磷酸盐、巴比妥盐和三羟甲基氨基甲烷-乙二胺基四乙酸缓冲液等。要求缓冲液的物质性能稳定，不易电解。血清蛋白分离时最常用的是巴比妥-巴比妥钠组成的缓冲液。
3．浓度缓冲液的浓度可用摩尔或离子强度（I=1/2ΣCZ2）表示。离子强度增加，缓冲液所载的分电流也随之增加，样品所载的电流则降低。因此，样品的电泳速度减慢。但要注意的是离子强度增加使电泳时的总电流和产热也增加，对电泳是不利的。
在低离子强度时缓冲液所载的电流下降，样品所载的电流增加，因此加快了样品的电泳速度，低离子强度的缓冲液降低了总电流，结果减少了热量的产生。但是带电物质在支持介质上的扩散较为严重，使分辨力明显降低。所以对缓冲液离子强度的选择，必须两者兼顾，一般是在0.02~0.2M之间。
（四）支持介质对支持介质的要求是应具惰性较大的材料，且不与被分离的样品或缓冲液起化学反应。此外，还要求具有一定的坚韧度，不易断裂，容易保存。由于各种介质的精确结构对一种被分离物的移动速度有很大影响，所以对支持介质的选择应取决于被分离物质的类型。
1．吸附支持介质的表面对被分离物质具有吸附作用，使分离物质滞留而降低电泳速度，会出现样品的拖尾。由于对各种物质吸附力不同，因而降低了分离的分辨率。纸的吸附性最大，醋酸纤维薄膜的吸附作用很小。
2．电渗在电场中，液体对固体的相对移动称为电渗（图3-2），它是由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。水是极性分子，如滤纸中含有羟基使表面带负电荷，与表面接触的水溶液则带正电荷，溶液向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳时分离物质的电泳速度也受电渗的影响。如血清蛋白低压电泳，在巴比妥盐缓液pH=8.6、离子强度=0.06的条件下进行，蛋白质的移动方向与电渗现象的水溶液移动方向相反，蛋白质泳动的距离是等于电泳泳动距离减去电渗的距离，使电泳速度减慢。如果二者移动方向相同，蛋白质泳动距离是二者之和，则电泳速度加快。用琼脂凝胶作为支持介质，因琼脂中含有较多的硫酸根，固本表面带较多负电荷，电渗现象明显。在pH8.6的条件下电泳，许多球蛋白均向负极移动，因电渗移动的距离大于电泳距离，这个原理是对流免疫电泳的理论基础。
电渗现象可用不带电的有色颜料或用有色的葡聚糖点置在支持介质的二端中间，经电泳后可观察电渗作用对这些物质的移动方向和距离。
（五）温度对电泳的影响
电泳时电流通过支持介质可以产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）。产生热量对电泳技术是不利的，因为产热可促使支持介质上溶剂的蒸发，而影响缓冲溶液的离子强度。若产热温度过高可导致分离样品变性而使电泳失败。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可在电泳系统中安装冷却散热装置。对高压电泳增设冷却系统，以防样品在电泳时变性。
