做western上样前样品要混匀吗
Western Blot Quick Guide（以及一天跑完Western的时间规划）
前期准备：蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDS loading buffer混合，已经分装好，保存与-20°。头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。
8:00 从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。混合均匀并离心。
8:30 取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的枪加样。
9:00 开始电泳。恒流30mA一般1个小时足够了。
9:30 开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。
10:10 电泳结束（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。
11:00 转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用30分钟到50min，所以这里要抓紧时间）。
12:00 转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。开始封闭1h。
13:00 封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37° 1h然后在室温（23°左右）再1h。
15:00 一抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min。
15:30 开始孵育二抗。室温1h足够了。
16:30 二抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min，这里推荐采用5*6min。
17:00 ECL发光，压片10min，显影1min，定影10min，那么在18:00之前你就能看到结果了，呵呵，如果结果不好还有后招，用stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般20min就行，然后洗涤几次，重新封闭1h，然后一抗过夜，明日在继续战斗。这样的话18:30之前也能结束战斗了。
