目的基因分离最常用的方法及原理
1.从生物基因组群体中分离目的基因
原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。
图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段，每一种限制酶，都有自己特定的作用位点，而且切口或切下来的序列，往往是回文结构（palindromes）。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。多在原核生物中存在，能识别4～6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用，某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖，“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA，这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化（-CH3）而受到保护之故。
这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段，对于原核生物比较小的基因组来说，可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法，对于比较大的基因组，可以先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的片段。
2.人工合成目的基因DNA片段
人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。
3.PCR反应合成DNA
聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的原理如下：
图10-3-2 PCR原理图
（1）以混合的 DNA 片段作模板，例如，可以用 cDNA 基因文库做模板，在 90℃ 高温下，作为模板的双链 DNA 均变性，分开成为单链DNA。
（2）在反应体系中以有两种合成的 DNA 小段寡聚核苷酸做引物，这两种寡核苷酸应可以分别和特异 DNA 片段的正链的 3'末端与负链的 3'末端相结合。寡核苷酸引物要在 50℃ 的温度下，才能较好的找到可以配对的正链和负链，形成互补结合。显然，在混合 DNA 片段作模板的情况下，只有可以形成配对关系的 DNA 链才可特异性地结合引物寡核苷酸。这个过程又称为淬火。
（3）反应体系中还有高温 DNA 聚合酶，以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸（4 X dNTP) 。高温 DNA 聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌，俗称 Taq 酶。在 70℃ 高温下，经 Taq 酶催化，以四种脱氧核苷三磷酸为原料，在形成互补的引物寡核苷酸后，迅速合成一条与模板 DNA 单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。
（4）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从 90oC- 50oC- 75oC，反应体系中经历：变性（ DNA 双链变性生成单链）——淬火（寡核酸引物和特异的 DNA 模板结合，配对）——合成（以引物为起点，合成与模板互补的 DNA 新链）。每次循环约需6-10分钟。经过20次循环，能与引物特异结合的那段 DNA ——即需要放大增殖目的 DNA 分子，可以扩增106倍。
4.mRNA差异显示法获得目的基因
mRNA差异显示(mRNA differential display, DD)是1992年由哈佛医学院Peng Liang等人建立的。原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再次用PCR扩增。简单的讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。
5、用机械的方法，例如超声波把基因组打成片段。
