免疫球蛋白提取技术(Immunoglobulin isolation technique)
免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表着机体体液免疫的水平,并进一步代表着B细胞的功能,因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。
随着免疫学的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。
一、 IgG的分离与提纯
(一)材料与试剂配制
1.动物血清
2.硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。
注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。
3.0.01Mol/L pH7.4PB液
A液:0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液:0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可。
4.1%BaCl2溶液
5.纳氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。
6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7.洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。
8.透析袋(或玻璃纸)。
(二)操作方法
1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
2.3 000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4.3 000r/min离心20min,弃上清。
5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
6. 3 000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。
7. 用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
8. 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在),直至无SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9. 离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11.蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。
12.IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。
⑴ 区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
⑵ 琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
⑶ 免疫电泳鉴定:(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
⑷ 圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。
13.IgG的浓缩与保存
⑴ IgG的浓缩:参看本章第九节。
⑵ IgG的保存:一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。
(三)IgG的简易快速提取法
应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法。
1. DEAE-纤维素直接提取法
取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。
⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次。
⑵用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。
⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌。
⑷于4℃中放置1h,中间搅拌数次。
⑸用布氏漏斗抽滤,再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素,抽滤。滤液即为提取的IgG液。
2.DEAE-SephadexA-50为弱碱性阴离子交换剂,经NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ-G。这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得γ-G无变性现象。经过四次处理,其纯度也较好。缺点是收集量少,损耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE-SephadexA-50若干克,悬浮于蒸馏水中,1h后倾去上层小颗粒,然后用0.50Mol/L NaOH处理1h,蒸馏水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液体体积1/4的滤干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不时搅拌、抽滤、收集滤液。
⑶ 再用同样重量的DEAE-SephadexA-50处理滤液。反复处理三次。(全程共四次)。获得滤液即为γ-G制品。
⑷ DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱,抽滤至滤液中无蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。
(四)禽血清IgG的分离与提纯(Na2HPO4法)
1.试剂
⑴ 5%葡聚糖硫酸盐
⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
⑶ 无水硫酸钠
⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液
⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
2.操作方法
⑴ 取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,静置,然后离心去沉淀,此步目的是为了去掉脂类物质。
⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g,缓慢加入,混匀,静置30min,3 000r/min离心去上清。
⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g/ml,同上法离心去上清。
⑷ 重复步骤⑶,加Na2SO4,使成0.14g/ml。
⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀,然后装透析袋除盐48h。
⑹ 过SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。
⑺ 如要进一步提纯,则用第二峰再过DEAE—纤维素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗脱下来的蛋白液即为IgG。
也可以按以下操作方法进行:
⑴ 以18%硫酸钠(W/V)提取一次,再以14%的硫酸钠提取一次。
⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入无水硫酸钠,离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠,离心。将两沉淀溶解、混合,在常水中透析过夜,再在生理盐水中4℃透析,直至无SO42-为止。
⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
⑷ 过SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱,收集洗脱液,取第二峰即为鸡IgG。
二、IgM的分离与提纯
(一)材料
1.血清
2.葡聚糖凝胶G200
3.洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris-HCl+0.14Mol/L NaCl)。
(二) 操作方法
选取2.50cm×90cm层析柱,用葡聚糖凝胶G200装柱,平衡后,直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品,洗脱液洗脱,流速0.25ml/min,分管收集,测OD280值,第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合,浓缩、鉴定。
二、 IgA的分离与提纯
(一)材料与试剂配制
1.DEAE52纤维素
2.0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4·7H2O 2.88g
加水至1 000.00ml
3.饱和硫酸铵溶液
4.10%EDTA—Na
5.SephadexG200
6.0.01Mol/L pH7.4PB液
7.0.10Mol/L pH6.4PB液
8.血清
(二)操作方法
1.取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液,调pH至7.0,室温搅拌1h,离心去沉淀。
2.于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置30min或冰箱过夜。
3.10 000r/min离心10min,去上清。
4.取沉淀溶于4ml10%EDTA-Na溶液中。
5.生理盐水中透析除盐。
6.过DE52柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白(IgG)弃去。
7.换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱,收集蛋白峰,即为IgA。
8.再过SephadexG200柱,洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl),收集洗脱液测OD280值,取第一峰即为纯化IgA。
9.透析、浓缩、鉴定。
四、分泌型IgA的分离与鉴定
(一)材料与试剂
1.初乳
2.SephadexG200
3.0.10Mol/L pH6.8PB液
4.0.01Mol/L pH7.4PB液
5.DEAE52
(二)操作方法
1.取初乳20ml,10 000rpm离心10min,弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。
2.取乳清过SephadexG200柱(柱规格为2.50cm×90cm),以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱,第一峰为IgA(含IgG)。
3. 收集乳液,于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
4. 将透析液浓缩至5mg/ml以上。
5. 过DE52层析柱,用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱,洗下蛋白峰为IgG,弃去。
6. 换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS(0.10Mol/L NaCl)液洗脱,
收集洗脱液 ,即为较纯的IgA液。
7. 必要时,可再过一次SephadexG200柱。
8. 浓缩,鉴定
五、禽IgA提取与纯化
(一)材料与试剂配制
1.禽胆汁
2.饱和硫酸铵溶液
3.0.01Mol/L pH7.4PBS液
4.0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
5. DEAE52-纤维素
(二)操作方法
1.取冷藏的胆汁3Ⅹml,缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使成25%饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
2. 3 000r/min离心30min,去沉淀。
3. 取上清,加饱和硫酸铵液,使成35%的饱和度,4℃放置30min。
4. 3 000r/min离心30min,弃上清。
5. 取沉淀,加0.85%NaCl液溶解,加饱和硫酸铵溶液,重复步骤3和4三次。
6. 将沉淀用0.85%NaCl液溶解,装入透析袋,以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7. 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡,过DEAE52纤维柱(20×250mm)。
8. 取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
9. 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl浓度为0.30Mol/L)洗脱,收集洗脱液。
10.浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml,分装,低温冰箱保存。
六、IgE的分离与提纯
(一)材料与试剂
1.血清
2.饱和硫酸铵溶液
3.洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液
0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)
4.DE52
5.SephadexG150
(二)操作方法
1.取血清倍比稀释后,加等量饱和(NH4)2SO4溶液,盐析。
2.离心取沉淀,溶于少量生理盐水中,透析、除盐。
3.过DE52柱,以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱,收集洗脱蛋白峰(IgG),弃去。
4.换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗下的蛋白峰主要是IgE。
5.透析除盐。
6.过G150柱,以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液即为纯化的IgE。
7. 浓缩、鉴定。
七、连续提取免疫球蛋白法
(一)试剂及配制
1.饱和硫酸铵液
2.各种磷酸盐缓冲液
⑴ 0.2mol/L原液
A液:0.20Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·H2O 31.20g
H2O 1 000ml
B液:0.20Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.7g
H2O 1 000ml
⑵ 0.10Mol/L pH8.0PB液
A液: 53ml
B液: 947ml
H2O 加至 2 000ml
⑶ 0.005Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液100ml,加H2O至2 000ml
⑷0.025 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液500ml,加水至2 000ml。
⑸ 0.035 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10.1 Mol/L pH8.0 PB液700ml,加水至2 000ml。
⑹ 0.10Mol/L pH5.8PB液
A: 920ml
B: 80ml
H2O 加至 2 000ml
⑺ 0.40Mol/L pH5.2pB液
a液.0.40Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 62.40g
H2O 加至 1 000ml
B液.0.40Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 143.4g
H2O 加至 1 000ml
取a液 960ml
b液 40ml
混合即可。
⑻ 0.01 Mol/L pH8.0PBS液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液 100ml
NaCl 8.20g
H2O 加至 1 000ml
3.DEAE-纤维素(细粒级)
4.SephadexG200
(二)操作方法
1.取一定量的血清,加等量的生理盐水,然后逐渐滴加饱和硫酸铵溶液,使成40%的饱和度,静置30min。
2.10 000r/min离心10min,去上清。
3.加入一定量的生理盐水,使沉淀溶解,再加入饱和硫酸铵溶液,使成40%饱和度。10 000r/min离心10min,去上清。
4.再重复步骤3一次。
5.将沉淀以少量生理盐水溶解,透析,除盐浓缩。
6.制备DEAE-纤维素柱,以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。
同时制备SephadexG200凝胶柱,以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并进行洗脱。
7.以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白液为IgG。
8. 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白主要是IgE,再过SephadexG200凝胶柱,收集第一峰即为纯IgE。
9.以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白主要是IgA,再过SephadexG200凝胶柱,收集第一峰即为纯IgA。
10.以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脱,洗脱液主要有IgM、IgG及白蛋白的混杂物。
11.以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脱,得蛋白液主要是IgM。过SephadexG200,收
集第二峰即为纯IgM。
八、Fab片段的制备方法
利用胃蛋白酶分解IgG,将抗体断链为Fab和Fc片段。具体操作方法如下:
1.将IgG粉末100mg,溶于2ml0.10Mol/L pH4.0醋酸缓冲液。溶液稍成白浊,30℃,保温10min。
2.取结晶胃蛋白酶1.50mg,溶于1.50ml 0.10Mol/L pH4.0醋酸缓冲液,加入上述溶液中,于30℃作用16h。
3.用0.10Mol/L pH8.0 PBS透析一夜。
4.加入硫醇使成0.10mol/L,在室温下搅拌30min。
5.加入1Mol/L的碘乙酰胺(Indoacetamide)使成为0.10Mol/L,室温下搅拌1h。
6.用0.01Mol/L PBS 1 000ml透析过夜,3 000r/min,离心30min,去沉淀。
7.以上清过SephadexG100(40cm×2.0cm)以0.10Mol/L PBS洗脱。
8.以每管6ml收集,约在第8管开始,Fab片段被洗脱。
9.测OD280nm,将Fab管合并,浓缩、冻干。
10.如制备F(ab)2,上述4~6步骤则可以省略。