反转录病毒原液检测实验
| 实验材料 | 病毒细胞 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | polybrene 小牛血清 DMEM |
| 仪器、耗材 | 培养皿 滤膜 |
| 实验步骤 |
1. 在开始分析的前1天，按1：50将NIH 3T3细胞分传于3个6 cm 培养皿中。将1个培养皿标记为阳性对照，1个为阴性对照，1个用于待测病毒原液。
3. 含有选择标记的阳对照的制备：制备1 ml 无辅助病毒的病毒原液与10~100 CFU辅助病毒原液的混合液。加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通过0.45 μm 滤器过滤除菌。
4. 阴性对照病毒原液的制备：制备1 ml 无辅助病毒的病毒原液，加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通过0.45 μm滤器过滤除菌。
5. 用各病毒原液感染培养皿上的细胞。将感染后的3个培养皿置于37℃ CO2培养箱中温育1~3 h以利于吸收，加4 ml DMEM-10培养至细胞汇片。
6. 将细胞按1：50分传于新的6 cm 培养皿中。3个培养皿中每个仅传一个培养皿，弃去原来感染的细胞的无用的部分。使polybrene的终浓度在2 μg/ml 培养至细胞长到50%~90%汇片。 7. 弃去培养液换以半量的新鲜DMEM-10。再培养2~3天。
8. 收获生长汇片的细胞的最终的上清。经0.45 μm 滤膜过滤，加polybrene至终浓度8 μg/ml。保存于-70℃~ -80℃，或立即用于滴定及分析标记抗性。
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