溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
一、实验目的和内容
目的：1. 通过本次实验的学习与操作，使学生在实验过程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；
2. 要求学生掌握电泳原理以及SDS－PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术；
3. 熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，凝胶图谱的绘制与计算；
4. 了解在电泳中分子量标准物的使用。
内容：1．SDS-PAGE电泳的原理：SDS使蛋白质的变性作用，以及此实验中采用的使不连续PAGE胶（分离胶和浓缩胶）的原理；
2．SDS－PAGE电泳进行纯度鉴定的原理：凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关；
3．电泳的操作：制胶、加样、电泳、拨胶、凝胶染色与脱色；
4．蛋白条带的观察以及分子量的估算。
二、实验仪器与试剂
1．实验仪器
SDS-PAGE电泳设备，电炉，脱色摇床
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
2. 实验材料及试剂
实验材料：蛋清（S1）、粗分离样品（S2）、离子交换层析中穿透峰下降段样品（S3）、离子交换层析洗脱峰样品（S4），橡胶手套
实验试剂：2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl
缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3
Tris-Gly电泳缓冲液、1%琼脂糖溶液、染色液、脱色液
三、实验步骤
（一）蛋白样品的处理
取200µL 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200µL 的2×上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100℃沸水浴中加热3～5min，取出后10000r/min 离心10min，取上清待用。
（二）SDS-PADE实验步骤（适用于大板，若为天能公司的小板，参考附录中的方法）
1．电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。( 试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。)
2．用电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸溶解后冷却至55℃左右，加入制板槽槽内封板。（固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.）
3．按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。（凝胶配制过程要迅速,
催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。）
4．倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置25分钟。（样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。）
5．拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。（要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.）
6．加样5个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加样量为2µL，S1、S2、S3、和S4加样量为10µL。为了练习和比较上样量的影响，可以加20µL的S1～S4作为对照（注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。）
7．电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160V，当进入分离胶后改为240V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
8．凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42℃染色40min左右。（剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。）
9．脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
10．将凝胶室温保存于10％甘油水溶液中，至凝胶扫描分析。
11．凝胶扫描仪扫描并进行数据分析,求出溶菌酶的相对分子质量。分析各样品中溶菌酶相对含量的变化。
附表1
| 浓缩胶 （10mL） | 双蒸水 | 0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl | 胶贮液 | 10%SDS | TEMED | 10%AP |
| 4% | 6.1mL | 2.5mL | 1.3mL | 100μL | 10μL | 100μL |
附表2
| 分离胶 （20mL） | 双蒸水 | 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl | 胶贮液 | 10%SDS | TEMED | 10%AP |
| 12% | 6.6mL | 5mL | 8mL | 200μL | 8μL | 200μL |
汇总所有实验结果，完成下表：
|
样品 |
体积 mL |
蛋白浓度mg/mL |
总蛋白 Mg |
活力 u/mL |
比活力 u/mg |
总活力 U |
回收率 % |
提纯倍数 |
|
S1 |
V1＝ |
100 | 1 | |||||
|
S2 |
V2＝ |
|||||||
|
S4 |
V4＝ |
其中：总活力＝比活力×体积
回收率＝回收的样品活力占总活力的百分数
提纯倍数＝提纯的比活力与初始比活力的比值
四、注意事项
1．N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。
2．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。
3．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。
4．加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
五、演示
1．垂直电泳系统的组成及工作原理；
（1）电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽
（2）电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200～600V，载体两性电解质等电聚焦电泳1000～2000V，固相梯度等电聚焦3000～8000V
（3）外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却；
（4）灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；
（5）其他：可以选配电泳转移装置、电泳洗脱仪、凝胶扫描和摄录装置等。
2．制分离胶与浓缩胶。
