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分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

IL-2生物学活性检测实验

2019.4.07

白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。

实验材料

人外周血T细胞

试剂、试剂盒

FCS-RPMI-1640培养液谷氨酰胺HEPES青霉素链霉素PBSA缓冲液

仪器、耗材

离心机分光光度计摇床

实验步骤

一、人外周血T细胞分泌IL-2的诱生


1.  人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为


2.  加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.51 ml，每孔再加PHA 0.5 ml，37度，5%CO2孵育48小时。


3.  回收上清：吸出细胞培养上清，12000 r/min 离心15分钟，收集上清，-20度冻存。


二、IL-2生物活性测定


1.  CTLL-2细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000 r/min 离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。


2.  加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1 ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1 ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100 ul 细胞+100 ul 培养液）。37度，5%CO2孵育40小时。


3.  MTT掺入：轻轻吸取上清液100 ul，加MTT（1 mg/ml）100 ul，37度，5%CO2孵育2小时。


4.  测定：离心培养板，2000 r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100 ul DMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570 nm 测吸光值（A）。


5.  计算：用标准品浓度和对应的净A570 nm 值（实验孔-阴性对照孔的A570 nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。

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注意事项

1.  CTLL-2细胞存活率应大于95%。


2.  因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4 mAb吸附剂除去IL-4。


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