LiCl法转化毕赤酵母菌
实验概要
本实验介绍了用LiCl法将重组质粒导入毕赤酵母菌X-33的转化方法。
主要试剂
甘油，YPD培养基，50% PEG，1 mol/L LiCl，Sac I
主要设备
摇床，高速离心机，1.5 ml微量离心管，水浴锅
实验材料
重组质粒pPIC6αA-APC，毕赤酵母菌X-33
实验步骤
1. 取毕赤酵母甘油种400 ul至50 ml YPD培养基中，30℃振荡培养(8-10 h)至OD600~1.0；
2. 离心1500 r/min，10 min，收集新活化好的酵母细胞；
3. 再用25 ml无菌蒸馏水冲洗，室温下1500 r/min离心10 min，弃去水；
4. 用lml 0.1 mol/L LiCl重悬细胞，转入1.5 ml微量离心管中，高速离心(10000 r/min，15s)后收集细胞；
5. 用400 ul 0.lmol/L LiCl重悬细胞，每管50 ul分装于1.5 ml eppendorf管中，高速离心(10000 r/min，15 s，用吸管吸去LiCl；
6. 依次加入下列试剂：240 ul 50% PEG，36 ul 1 mol/L LiCl，25 X12 mg/ml单链DNA，Sac I线性化pPIC6αA-APC (5-10 mg)置于50 ul无菌蒸馏水，振荡混匀细胞，30℃静置孵育30 min；
7. 于42℃水中热休克20 min；
8. 8000 r/min离心3 min，吸去转化液，用1 ml YPD重悬细胞，30℃摇床孵育(1-4h)；
9. 取200 ul上述转化菌液于YPD固体培养基中(加入Blasticidin，再取200 ul于YPD固体培养基中(不加Blasticidin)作对照，30℃孵育2-3 d到出现转化菌落。另取30ul新活化酵母菌液于YPD固体培养基(加入Blasticidin)作对照；再将Sac I酶切的质粒DNA 30 ul于YPD固体培养基(不加Blasticidin)作对照。30℃孵育2-3 d，观察结果。
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焦点事件
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