TA克隆的策略
对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。虽说效果不错，可着实有些麻烦。载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。做表达的那是没办法，载体上只有多克隆位点，那我们只能配合。对于只是想克隆保存或测序的同学来说，快速简便的TA
克隆则不失为一个好选择。
TA 克隆的idea 最初来自1994 年。几位学者发现Taq
DNA聚合酶会在PCR产物的3’末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。之后，Invitrogen 公司发明了TA
克隆技术，并拥有全球TA cloning 商标的ZL权，直至2013 年。（这个就够他们赚得盆满钵满了。）线性化的T
载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR 产物的A 尾巴互补。原理就是这么简单。不过由于价格的原因，Invitrogen 的T
载体在国内却不是销量最好的。Promega 的pGEM-T（easy）和Takara 的pMD18-T 因性价比高，更加深入人心。
TA 克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。
用什么样的聚合酶？
不是所有的聚合酶都会在PCR产物末端加A。具有3’到5’外切酶活性的高保真酶就不会产生A
尾巴。如果你下一步想要做基因表达，一定要用高保真酶，那也没问题。只要用Taq 酶在产物末端加个A 就OK。步骤也很简单，根本无需买个什么加 A
试剂盒，几步就搞定了。
1. 用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入 0.7-1 unit 的Taq 聚合酶。无需更换buffer，其中的dATP 已经够用。
2. 在72℃孵育8-10 分钟。
3. 立即进行纯化，沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会将A 尾巴或T 载体上的T 尾巴切掉。
有些高效率的聚合酶其实是Taq 酶和高保真酶的混合物，大约有一半的产物加了A 尾巴。所以你在克隆之前最好搞清楚你用的酶到底是否加 A，否则克隆出来白斑太少，又要讨论好久。
PCR 产物的纯度
如果你的PCR 产物只有唯一条带，恭喜你。不过为保险起见，最好还是用PCR
产物纯化试剂盒来纯化一次。否则白色菌落中的插入片段可能是引物二聚体哦。如果你发现有非特异条带，那最好优化一下PCR
反应，让非特异条带消失。跑胶纯化是下策，因为胶纯化可能会带走3’的A 尾巴。而且注意不要在紫外灯下暴露太久。只需5 秒，紫外对DNA
的伤害就足以检测；而长达60 秒的照射会让某段序列在测序时无法读取。问题远比你想象中严重。
易生物提示：PCR 产物其实也有保质期。为了保证连接效率，PCR 产物最好不要超过一天。因为上面的A 尾巴会随着时间逐渐降解，导致连接效率下降。千万不要为了省事，就整个一大管 PCR 产物，每次用一点。最终反而更浪费时间。
载体和片段的比例
这往往是影响克隆效果的最大因素。通常来说，载体与片段的起始摩尔比为1：1。计算方法如下：
X ng PCR 产物 = （ng 载体 × kb 片段大小） / kb 载体大小
如果这样的比例不能令你满意，你可以在3： 1 到1：3 的范围内进行优化，选择最佳的比例。 PCR 产物的浓度可以通过与Marker
比对估算出来。还有一种更准确的方法，用GE 的NanoVue 超微量分光光度计。只需要0.5
ul，就能测量出样品浓度，你再也不用舍不得珍贵的样品了。0.5 ul 而已，小意思。
对照
托尔斯泰曾说过：“幸福的家庭总是相似的，不幸的家庭各有各的不幸。”实验也是如此。失败的实验总有各种各样的缘由。对照在实验失败时就凸显其重要性了。
阳性对照
一般在购买TA 克隆的kit 时，都会附带阳性对照。你应该在第一次实验的时候，就按照说明书上对照反应的步骤，同时进行阳性对照，以检验 PCR
和连接反应是否有问题。而不是在失败了七八次之后，才想起阳性对照。浪费了时间不说，如果你的样品很珍贵，那谁也无力回天。一般说来，起码有60%以上的菌落应该是白色的。
自连对照
这个对照是检验T 载体的T 尾巴是否还在。如果转化后出现大量菌落，这个T 载体一定有问题。
转化对照
每一次转化实验都应该设立对照。自家制备感受态细胞是这样，购买现成的感受态更是这样。因为感受态细胞非常敏感，绝对不能冻融。从外地长途运输过来，谁知道中途发生过什么事。为保险起见，一定要转化一个环状的质粒（非T
载体，因为它们已经线性化了）作为对照。如果没有看到密密麻麻的菌落，这个感受态基本就是不合格的。 TA
克隆的效率主要与片段长短有关，片段越长，效率越低。一般的TA 克隆试剂盒适用于3kb
以下的片段。如果你的片段很长，最好选择一些特别的长片段克隆试剂盒。
