DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤（一）
【实验原理】
1．DNA重组技术
重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤：
1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备
常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH
12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析
限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定，Ⅲ型其切割位点在识别位点之外，只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状DNA（DNA分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定。
【实验用品】
1．PCR扩增仪；恒温振荡培养箱；超净工作台；细菌恒温培养箱；台式高速离心机；电热恒温水浴箱；冰箱；电泳仪； 电泳槽，样品槽模板（梳子）；紫外灯；保鲜膜；一次性塑料手套；凝胶自动成像仪。
2．三角烧瓶（500ml, 250ml,100ml）,培养皿，玻璃试管，试管塞，玻璃棒，酒精灯，镊子，脱脂棉，纱布，乙醇，容器盒。
3．微量加样器（1000μl,200μl，20μl）；Tip头（1000μl,200μl，20μl）。Tip头盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明胶带。
4．DNA重组相关试剂：
1）Taq DNA聚合酶，缓冲液，dNTP，特异性引物，靶DNA；凝胶回收试剂盒；TA克隆载体：pMD18-T；感受态细菌；氨苄青霉素（100mg/ml）。
2） LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，10N NaOH调pH至7.0定容至1L。15磅高压消毒，4℃保存。
3）LB琼脂培养基：15g琼脂粉溶于1000ml LB培养基，15磅高压消毒备用。
5．质粒提取试剂：
溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高压消毒，4℃保存备用.
溶液Ⅱ:0.2N NaOH;1%SDS 室温贮存，即用即配。
溶液Ⅲ:3M NaOAc(pH4.8) 10磅高压消毒,室温贮存。
RNA酶 A: 10mg/ml
TE缓冲液：10mM Tris-Cl (pH7.6)，1mM EDTA(pH8.0)
6．质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳相关试剂：
限制性内切酶Hind Ⅲ、XbalⅠ及酶反应所需缓冲液；琼脂糖；溴化乙啶贮存液（10mg/ml）；6×载样缓冲液。
Tris-乙酸(TAE)贮存液：
50×：242克Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
加水至1L
