血小板功能——实验室评估抗血小板治疗有效性的方法
心血管疾病作为美国乃至全球第一杀手，占到患者死亡的30%左右。研究者现在发现动脉粥样硬化斑块是随着时间的推移出现的。但是，当斑块破裂时相关成分会出现在动脉细胞外基质中，从而开启血小板凝集功能或动脉血栓。与此同时，巨噬细胞来源泡沫细胞产生的组织因素也会启动血液系统的凝集作用。这些过程均可引起血块的增加，且能引起从中风到心肌梗死（MI）的临床疾病。
现在，血小板抑制剂已成为急性心血管事件预防和治疗原则的主要用药。其中，三种主要的血小板抑制剂是：阿司匹林，包括氯吡格雷在内的噻吩吡啶类派生物和GP IIb/IIIa受体拮抗剂。因为GP IIb/IIIa拮抗剂仅能以静脉形式获得，无法用于医院外患者的长期治疗。另一方面，患者经常服用阿司匹林和氯吡格雷来降低心脏疾病的长期风险。
近来，关于临床实验室是否应该测量阿司匹林和氯吡格雷对血小板功能作用的问题存在着越来越大的争论。本文讨论了测量这些抗血小板药物作用的药理学和可获得的实验室检测。
血小板和血块形成
血小板在正常止血过程中起到主要作用。他们没有细胞核，但含有纤维蛋白原、血小板派生生长因子、凝血因子（vWF）、P-选择素构成的α-颗粒及二磷酸腺苷（ADP）、血清素和钙组成的密集颗粒。
当发生血管损伤时，暴露的vEF和胶原蛋白结合到循环血小板上并激活他们。激活过程中，释放α和致集颗粒（脱粒过程）从而聚集更多血小板到达血管损伤位置并增强血小板活性。血小板也能合成和释放凝血烷（另一种活性调节物质）。
血小板活性过程中，细胞表面的GP IIb/IIIa受体变形，从而使纤维蛋白原（因子I）结合到血小板上。同时，作为血凝固的一部分，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。因子XIII在血凝固过程最后一步交叉连接纤维蛋白。这种复杂的相互作用结果是引起稳定血小板形成或构成基本的止血（图1）。
该简化图形展示了血液凝块形成的基本步骤。体外血液凝固过程是两种不同方式的结果，血液凝集（左边）和血小板激活（右）。
阿司匹林：作用机制
阿司匹林（乙酰水杨酸）作为一种止痛药已经存在很长的历史了，可以减轻轻微的痛苦。这种价格便宜、广泛可获得的药物同样也可以降低男性出现原发MI的风险以及女性中风风险。在有高风险血管疾病患者中，该药可使血管疾病、MI和中风引起的死亡率降低25%。同时有证据表明阿司匹林可用于防止冠状动脉疾病、脑血管疾病或周围血管疾病患者出现继发血管疾病。
阿司匹林发挥作用是通过使环氧酶1（COX-1）丝氨酸530发生不可逆转乙酰化实现的。这种酶在将花生四烯酸转换为增强血小板聚集（兴奋剂）或降低血小板聚集（拮抗剂）物质过程中扮演着关键作用。研究表明：与类似环前列腺素和其他花生四烯酸代谢物的拮抗剂相比，阿司匹林能在更大程度上通过减少凝血烷的产生来降低心血管疾病风险。因此，阿司匹林的有效作用是降低血小板凝集。
阿司匹林抵抗定义
阿司匹林对血小板功能作用的定义有很多不同的方法，定义个体对阿司匹林治疗的抵抗同样具有很多不同的方法。研究者已提议了多种依据血小板功能检测、血清或尿液凝血烷代谢物以及抵抗的药理学机制制定的阿司匹林抵抗实验室定义。
对 I 型或药代动力学抵抗个体，即使服用了合适剂量的阿司匹林也无法抑制COX-1。研究表明这些患者血液中的水杨酸盐因吸收不良或COX-1基因多态性而无法达到抑制COX-1的高水平。II型或药代动力学抵抗个体中，尽管COX-1得到适当抑制，但凝血烷仍不断产生。其他类似COX-2的酶也能产生凝血烷，这可以用来解释该类型的阿司匹林阻抗。假抗性抵抗或III型个体中，阿司匹林可有效阻止凝血烷的产生。血小板活性仍能通过凝血烷独立通道起作用，如凝血酶、ADP或血小板的肾上腺素活性。虽然这些定义可以帮助我们了解各种引起血小板活性或动脉血栓形成（即使在患者服用阿司匹林的情况下）的生物学机制，但更重要的是要意识到目前不存在阿司匹林抵抗的标准定义。
测量阿司匹林对血小板功能作用的检测
实验室可选择几种方法来测量接受阿司匹林治疗患者的血小板功能。
光传输集合度测定。目前的金标准方法是光传输集合度测定（LTA）。该检测要求使用柠檬酸盐化血液样本，即将样本进行离心处理从而获得血小板丰富的血浆，其中血小板计数是200-300 x10^9/L。进行此项检测时，技术人员将血小板丰富的血浆样本置入加有血小板兴奋剂的凝集计容器内诱导血小板凝集，兴奋剂可以是ADP、花生四烯酸或肾上腺素。随着血小板凝集，容器内富含血小板的血浆浊度就逐渐降低。浊度的衡量方法是随着时间的前进，测量增大的透光率。可用于LTA的凝集计可从几个厂家中获得。
研究已证明年龄、性别、种族和血细胞比容均会影响LTA测量到的血小板凝集。此外，与样本采集和处理过程中与血小板活性相关的分析前变量会使结果出现变化。虽然LTA测量的阿司匹林抵抗目前还没有普遍一致接受的定义，但许多研究采用了对花生四烯酸反应≥20%的聚集或对ADP反应≥70%的聚集作为测量指标。
大部分实验室更喜欢LTA，因为它是几种可以预测患者对阿司匹林治疗结果检测中的一种。例如， 研究中LTA获得血小板活性更多的个体出现的心血管疾病越多。不过，该检测存在一些缺点，包括花费大量的时间和劳力、难于达到标准化，且操作者在检测过程中会出现很多变量。
体外出血时间。这是另一种可在特殊仪器上获得的一种评价血小板功能的检测技术。血小板功能分析仪-100（PFA-100，西门子医疗诊断，图2）采用了ZL技术，方法是让血液流过一孔径很小的、包被有降低血小板凝集兴奋剂的毛细管。随着血小板功能激活，血小板粘附到孔径中，阻止血液流过毛细管。仪器测量孔径出现凝集的时间，并将其作为体外凝固时间进行报告。因为这种方法与传统出血时间检测的类似性，有时会将血小板功能检测结果作为“体外出血时间”。
采用PFA-100进行的研究显示大部分接受阿司匹林治疗的患者体外血液凝固时间会延长。但是，服用阿司匹林但血液凝固时间仍相对正常的患者所占百分数范围过大，这也是该检测技术其中一个潜在缺点。
阿司匹林抵抗PFA-100检测同时也有一些独特的优点。最为显著的是它的快速性，并能采用全血进行检测，意味着患者可在很多医疗环境中接受检测。此外，与LTA获得的结果相比，实验室可更好的实现PFA-100检测结果的标准化，同时也能利用该检测评价遗传性血小板疾病。从消极方面来看，进行的研究为阿司匹林抵抗定义采用了各种各样的临界值，而且所采用的技术并不特定于阿司匹林抵抗。例如，血管性血友病患者和其他血小板异常患者即使没有服用阿司匹林也会出现体外血液凝固时间延长的现象。血细胞比容和血小板计数也会对检测结果产生影响。
血小板功能分析仪-100检测血小板功能，并采用高剪力流环境来模拟体外止血。该仪器采用的是全血，在4-8分钟内获得结果。
暗盒型血小板聚集。VerifyNow阿司匹林检测（Accumetrics，图3）是另一种评估阿司匹林对血小板功能作用的ZL技术。检测暗盒含有特异性凝血烷诱导血小板活性的催化剂，从而使得该检测测量阿司匹林诱导血小板抑制的特异性优于体外出血时间检测。检测盒内，纤维蛋白原包被的微粒聚集起来应对血小板活性，使增强的透光率与LTA类似。Accumetrics推荐的临界值高于对阿司匹林治疗反应次佳患者的值。数值以公司定义的任意聚集单位进行报告。
VerifyNow技术的一个主要优势是周转时间快、采用全血。一般来说，与PAF-100相比，该检测也能鉴别少部分抵抗患者。另一方面，该检测获得的结果与其他被认为是评价阿司匹林作用金标准的检测（如LTA和血清或尿凝血烷代谢物测量）结果之间的一致性比较差。
VerifyNow仪器是一款自动化分析仪，采用一次性暗盒来测量血小板功能。床旁仪器能够检测阿司匹林和氯吡格雷，可在5分钟或更短时间内获得检测结果。
氯吡格雷：作用机制
临床医生用氯吡格雷来降低心血管疾病患者MI、不稳定型心绞痛、中风以及心血管疾病死亡风险。这种口服性、噻吩吡啶类抗血小板药物可降低血小板活性，从而使患者不容易形成血块。
该药物工作原理是以共价、不可逆转形式与P2Y12受体结合。该受体是涉及到ADP-诱导血小板凝集的主要受体。该药物有效的代谢产物是在肝脏中进行的；因此，负责该药物代谢的CYP2C19肝脏酶的遗传多态性在对氯吡格雷抗血小板作用不同的个体中扮演者重要作用。
与阿司匹林抵抗检测一样，研究者采用了各种不同的氯吡格雷抵抗定义。最常见的实验室定义涉及到LTA中ADP诱导血小板凝集，测量是在服药前后进行的。许多调查研究者采用血小板凝集降低≥30%作为患者对药物出现有效反应的证据。抵抗的定义范围从LTA中ADP诱导凝集降低<10%到降低<20%。
测量氯吡格雷对血小板作用的检测
随着阿司匹林抵抗，可获得多种方法来测量氯吡格雷对血小板功能的作用。
光传输集合度测定。LTA一般被作为定义患者对氯吡格雷反应的金标准。该技术的优点包括其作为金标准的可接受性及其对ADP-诱导血小板活性药物真实药理学机制的特异性。该方法的缺点主要与用于监测阿司匹林治疗时的缺点一样：缺乏标准化，需要劳力，需要血小板丰富的血浆。
暗盒型血小板聚集。VerifyNow P2Y12检测（Accumetrics）也可测量氯吡格雷血小板凝血的有效性。同样的检测也可用于其它P2Y12抑制剂中。该设备的原理与阿司匹林检测原理一样，但该暗盒采用ADP来诱导血小板凝集，并通过对比凝血烷（一种具有潜能的血小板拮抗剂）存在时活性的方法使结果标准化。检测报告氯吡格雷抑制血小板活性的比例方法是将ADP诱导血小板活性与凝血烷诱导凝集相对比。
该检测技术可采用全血样本快速获得结果，对氯吡格雷诱导血小板抑制来说具有相对的特异性。但是，检测结果与LTA的结果一致性相对较差。研究者也报道了患者各种各样的反应，其中有些研究发现患者产生抵抗反应的百分数是45%-50%。此外，血小板计数及其他血小板抑制剂的使用也会对检测结果产生影响。
凝血弹性描记法（TEG）。该方法是另外一种评价氯吡格雷对血小板功能作用的方法（图4）。进行该项检测时，技术人员将缺血添加到包被启动血液凝固拮抗剂的塑料杯中。该仪器扭丝上有一大头针。当大头针高度降低到杯中时，杯子开始旋转，引起血液凝固。凝固使扭丝产生拉力，然后仪器随着时间将这种变化描绘出来得出一个曲线图。曲线的最大振幅（MA）反映的是血小板功能。为了评估氯吡格雷的反应，采用ADP-、纤维蛋白-和高岭土包被的杯子运行检测。与VerifyNow P2Y12检测类似，MA对ADP的反应情况转换为纤维蛋白和高岭土MA值，从而来评估患者血小板功能受ADP受体抑制剂的影响程度。
有些实验室更喜欢TEG，因为这种方法采用的是全血并可同时应用花生四烯酸、纤维蛋白和高岭土作为兴奋剂来评估阿司匹林对血小板功能的抑制作用。此外，该技术评估氯吡格雷对血小板影响具有相对特异性，可给每个检测提供血小板功能之外的信息，如凝血因子和纤维蛋白原浓度。但从另一方面来说TEG需要劳动力较大，且缺乏标准化。另外，检测结果取决于多个、相对不精确参数的计算。
凝血弹性描记法分析仪通过在全血样本中创建一个人工凝血环境来测量血小板功能。在扭丝和悬浮在特殊化样本杯的大头针之间形成凝块，然后仪器捕捉凝块形成的时间和最大凝结强度。患者对阿司匹林和氯吡格雷的抵抗均可采用该仪器进行测量。
其他方法
目前实验室存在多种评价阿司匹林或氯吡格雷治疗患者血小板功能的方法，而且其他新的技术也即将被使用。包括Platelet Works（海伦娜实验室）、Cone和Platelet分析仪（Matis Medical）以及各种血小板表面受体的流式细胞计数评估方法。流式细胞计数技术中，血管扩张刺激蛋白（VASP，Diagnostica Stago）引起了大家的格外关注。研究者已经在初步研究中将这种技术作为替代性金标准方法来评估氯吡格雷对血小板功能的影响。
结论
阿司匹林和氯吡格雷治疗已成为预防复发性动脉粥样硬化疾病和预防大部分高风险患者原发疾病的标准治疗方法。这两种药物通过不同的作用机制影响着血小板功能。阿司匹林降低了凝血烷调节性血小板凝集，而氯吡格雷主要阻止ADP诱发血小板活性。
因为患者对这些治疗表现出了不同的反应，所以实验室测量血小板功能可能会在某天对患者的成功治疗起到关键作用。但是，现在还不清楚哪种检测或设备能提供最有价值的血小板活性抑制评估结果。因此，实验室工作人员还需要密切关注该领域的最新进展。
