扫描电镜的微生物样品制备方法
微生物样品的扫描电镜观察广泛地应用于微生物学研究的各领域。为微生物资源的利用,微生物生物技术、遗传工程、环境保护等提供了大量直观的,有科研价值的形态学依据。 大多数微生物样品体积微小,使样品制备,尤其是临界点干燥,离子溅射等难于操作。积多年微生物制样的经验,我们介绍微生物中有代表性的细菌,霉菌的制样技术,其他微生物样品均可参照处理。
1 细菌
取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
(1)收集菌体:¹液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入215%戊二醛固定液;º固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2)固定,脱水按常规方法。215%戊二醛,2~4hy磷酸缓冲液清洗3次y1%锇酸4~6hy缓冲液清洗3次y乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20minP次y乙酸异戊酯置换2次,20minP次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。
(3)临界点干燥:普通定性滤纸裁成35mm@18mm的纸条,将长边 35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。
(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1P4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。
2 霉菌
取在固体培养基上旺盛生长的曲霉菌落。
(1)取材:在菌落四周用刀片划5mm@5mm见方小块。用刀片将小块挑出,片成2mm厚的薄片。材料投入装有戊二醛固定液的青霉素小瓶(因菌块易漂浮,用注射器从橡胶瓶塞刺入,抽出空气,使样块沉下)。
(2)固定,脱水,临界点干燥,离子溅射金参照组织块制样常规方法。
