关注公众号

关注公众号

手机扫码查看

手机查看

喜欢作者

打赏方式

微信支付微信支付
支付宝支付支付宝支付
×

透化细胞和退化细胞器蛋白质磷酸化—单层培养细胞透化

2019.4.03
实验材料

细胞培养物

试剂、试剂盒

HEPES

仪器、耗材

培养基

实验步骤

1. 约在实验开始前 1 小时,将细胞培养物换上含有预热(37℃)的 20 mmol/L HEPES(pH 7.2)的培养基,继续培养。让细胞在实验前与新培养基达成平衡。

2. 将所需数量的有细胞的培养基放在一个丝网托盘上,放入 37℃ 温箱再平衡 10 分钟。细胞在这种状态下能保持稳定 1 小时左右,这取决于培养基的蒸发速度。

3. 吸去培养基,立刻用预热的胞外缓冲液冲洗。

4. 去胞外缓冲液,换上透化缓冲液,加 60 单位/ml 的链球菌溶血素 O 储存液至终浓度 0.6 单位/ml。同时加 10 mmol/L 的冷 ATP 储存液至终浓度 100 μmol/L。

5. 37℃ 孵育处理过的细胞 1~5 分钟。

6. 加 [γ-32P] ATP 储存液至终浓度 50~500 μCi/mI。

7. 加入要研究的实验试剂,如药理试剂、多肽、Fab' 片段,放置一段时间让它们发挥作用。

8. 加入所需的受体激动剂。

9. 制备用于免疫沉淀分析的样品或者聚丙烯酰胺凝胶电泳样品。

展开


推荐
热点排行
一周推荐
关闭